رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل توليد خطوط خلايا مراسل لوسيفيراز والمراقبة اللاحقة لإيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة للخلية للتعبير عن التلألؤ البيولوجي. أولا ، قم ببناء مراسلي تعبير لوسيفيراز الفيروسي العدسي وإنتاج جزيئات الفيروسات العدسية ، والمضي قدما في إصابة الخلايا ذات الأهمية وتضخيم الثقافات المختارة. ثم راقب تعبير التلألؤ البيولوجي في خلايا المراسل المتزامنة باستخدام جهاز تسجيل مناسب.

في النهاية ، يتم استخدام تسجيل التلألؤ البيولوجي لإظهار إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة للخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعداء العابر وحماية السلالة الجرثومية هي أن VIR بوساطة. يوفر الجين تكاملا مستقرا في جينوم الخلايا ، بالإضافة إلى كفاءة أكبر وتنوع.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الساعة cied. على سبيل المثال ، هل هناك ساعات يومية خاصة بالأنسجة؟ إذا كان الأمر كذلك ، فما هي خصائص الساعات اليومية الخاصة بالأنسجة؟

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لآليات الساعة. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل ديناميكيات دورة الخلية ، وتكوين الأورام ، وما إلى ذلك. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا دراسة ساعات الأمان الخاصة بالأنسجة أو نوع الخلية.

سيوضح الإجراء الدكتور تشيتا نورم نابكين ، زميل ما بعد الدكتوراه ، وساندرا ، طالبة دراسات عليا من مختبري Atory. عادة ما يحتوي بناء مراسل الساعة البيولوجية للثدييات على شريط تعبير يتم فيه دمج محفز الساعة البيولوجية مع جين لوسيفيراز. في هذا المراسل الفيروسي ، يكون لوسيفيراز غير مستقر تحت سيطرة الفأر لكل مروجين.

للحصول على إرشادات مفصلة حول إنشاء متجهات المراسل عن طريق تفاعل إعادة التركيب ، راجع المخطوطة المصاحبة للحصول على تعداء فعال. ابدأ بثقافة خلايا الكلى الجنينية البشرية ذات العدد المنخفض من 90 إلى 100٪. الآن لطلاء ستة لوحات ثقافة جيدة.

بالنسبة للتعداء ، أضف ملليلتر واحد من 0.001٪ بولي ليسين إلى كل منها ، واحتضنه جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم اشطفه مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا باستخدام التربسين وزرع الخلايا في كل بئر من الألواح المطلية مسبقا. قم بتدوير الألواح للحصول على توزيع متساو للخلايا.

تحقق من أن الخلايا المصنفة قد وصلت إلى التقاء 80 إلى 90٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بإعداد مزيج تعداء البلازميد من البلازميد المراسل الفيروسي والحمض النووي وناقلات التغليف الثلاثة كعنصر تحكم لكل من التعدي والعدوى اللاحقة. قم بتضمين بئر إضافي لناقل تعبير GFP الفيروسي الذي يؤوي بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن تحت سيطرة محفز CMV.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من 0.25 مولار كلوريد الكالسيوم إلى البلازميدات واخلطها جيدا. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول XBBS واخلطه برفق ولكن جيدا. احتضان مزيج الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

أثناء الانتظار ، استبدل الوسط من خلايا 2 9 3 T بملليلترين من الوسط الطازج. أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل لموازنة درجة الحموضة المتوسطة. بعد ذلك ، بطريقة متنقلة ، أضف مزيج التعدي إلى الخلايا ، وقم بتدوير اللوحة برفق ، وراقب تكوين الجسيمات تحت المجهر ، ثم ضع الخلايا في حاضنة طوال الليل.

بعد حوالي 16 ساعة من التعدي ، قم بتجديد الوسط بملليلترين من DMEM الطازج والثقافة بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، لتقييم كفاءة التعدي ، قم بتقييم تعبير EGFP في خلايا التحكم في التعدي. تعد كفاءة التعداء من 90 إلى 100٪ مع تعبير EGFP العالي مؤشرا موثوقا به لإعداد فيروسي جيد.

حصاد الوسط الذي يحتوي على جزيئات فيروسية معدية مفرزة جهاز طرد مركزي لإزالة الخلايا التائية المتبقية 2 9 3 وجمع الفيروس المحتوي على الطافات. في اليوم الثالث بذرة ما يقرب من 12 ، 003 T ثلاث خلايا على 12 لوحة بئر ، استزراع بين عشية وضحاها إلى 20 إلى 30٪ من الطلاقة المشتركة ومراقبة الخلايا في اليوم الرابع. لا يزال في اليوم الرابع ، أضف الدماغ المتعدد إلى الوسط الذي تم جمعه والذي يحتوي على جزيئات فيروسية واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات.

الآن استنشق الوسط من الخلايا الثلاث T وأضف ملليلترا واحدا من الخليط الفيروسي لكل بئر. تحضن 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بعد غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، وتجديد الوسط واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل للتعافي والنمو. عندما تلتقي ، قم بتقسيم الخلايا والثقافة بين عشية وضحاها في اليوم التالي.

لبدء اختيار الخلايا المصابة ، أضف وسطا جديدا يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر. بغض النظر عن الانفجار ، يجب تحديد حمض الانفجار في سيارة القتل تجريبيا لكل خط خلية. تجديد الوسط الذي يحتوي على البلاستين كل يومين إلى ثلاثة أيام للاختيار المستمر للخلايا المقاومة للمضادات الحيوية.

التعبير عن مراسلي الساعة. بعد نشر ثقافة خلايا المراسل المقاومة للبلاستين في أطباق ثقافة 35 ملم حتى التقاء ، نقوم عادة بإعداد ثلاثة أطباق أو أكثر لكل خط خلية مراسل تحت كل شرط للنمط الظاهري سارسي. بعد غسل واحد باستخدام PBS ، أضف DMEM الذي يحتوي على 10 ميكرومولار فورلين أو 200 نانومولار ديكساميثازون محتضن 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لمزامنة الخلايا.

الآن ضع الخلايا في وسط تسجيل حديث. قم بتغطية أطباق الاستزراع بزلات غطاء معقمة مقاس 40 ملم وأغلقها في مكانها بشحم مفرغ من الهواء لمنع التبخر. قم بتحميل الأطباق على مقياس إضاءة الدورة اللوموسية وابدأ التلألؤ البيولوجي في الوقت الفعلي.

تسجيل لتسجيل 96 لوحة قديمة. مع GSR اثنان يسجل جهاز رأيت مخطوطة مرافقة. نسجل الإيقاع بسهولة لمدة خمسة إلى سبعة أيام في برنامج تحليل دورة lum.

خط الأساس الأول يناسب البيانات الأولية. ثم استخدم البيانات المطروحة الأساسية لتلائم موجة جيبية وحدد المعلمات المطلوبة للعينات التي تظهر إيقاعات ثابتة. يمكن تحقيق جودة بيانات الأقدام من 90٪ بسهولة بسبب Luminate العابر العالي.

استشعار التغيير والمتوسط. عادة ما نستبعد الدورة الأولى من البيانات من تحليلنا لعرض البيانات. ارسم البيانات الأولية مقابل الوقت عند الضرورة.

ارسم البيانات المطروحة لخط الأساس لمقارنة السعة والطور في كل من التعدي العابر للخلايا التائية 2 9 3 وفي عدوى خطوط الخلايا. تشير الصور الفلورية للخلايا التعبيرية عن GFP المنقولة والمحولة إلى أن نظام توصيل الجينات بوساطة الفيروسات العدسية عالي الكفاءة. تتكون حلقة التغذية الراجعة الأساسية للساعة البيولوجية من عوامل نسخية تعمل على عناصر محسن الساعة البيولوجية لإنتاج تعبير جيني إيقاعي.

هنا ، تنتج أربعة تركيبات مختلفة للمراسلين في ثلاث خلايا T ثلاث مراحل مميزة من تعبير المراسل. يمكن إنشاء مراحل وسيطة جديدة من خلال التنظيم التوافقي بواسطة عناصر يومية متعددة باستخدام ضربة قاضية للجينات عبر الحمض النووي الريبي والمركبات النشطة دوائيا. استخدمت هذه التجربة مقياس إضاءة دورة lum لتسجيل التلألؤ البيولوجي للخلايا في أطباق 35 ملم في خلايا U2 OS.

تم استخدام إيرنا لإلقاء الضوء على تأثيرات ضربة قاضية للبكاء واحد والبكاء جينين. هنا تم استخدام مقياس الإضاءة التآزري لتسجيل التلألؤ البيولوجي للخلايا. في صفيحة بئر 96 في ثلاث خلايا مراسل T.

تم استخدام الحمض النووي الريبي لتقييم تأثيرات ضربة قاضية ثلاثية على الإيقاعات الخلوية. في هذا المثال ، تم استخدام نظام UX ومقياس الإضاءة tecan لتسجيل التلألؤ البيولوجي للخلايا في 3 84. بينما تم تحديد اللوحات كما هو موضح ، يمكن للجزيئات الصغيرة أن تستهدف دوائيا وتزعج وظيفة البروتين في الإيقاعات الخلوية لخلايا مراسل U2 OS.

بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال البيولوجيا اليومية لاستكشاف آليات الساعة ووظائف الأعضاء في أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديه فهم جيد لكيفية إنشاء Lucifer والإبلاغ عن خطوط الخلايا ومراقبة وحدات التخزين.

ولا تنس أن العمل مع VIR يمكن أن يكون أوامر خطيرة للغاية ، ويجب دائما اتخاذ السلك ، مثل الحماية الشخصية وإزالة التلوث الفيروسي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.