رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

يفصل هذا البروتوكول عملية إنشاء خطوط خلوية مراسلة تعبر عن لوسيفيريز (luciferase) والمراقبة اللاحقة للإيقاعات اليوماوية ذاتية الخلية لتعبير bioluminescence. أولاً، يتم بناء مراسلات تعبير لوسيفيريز عبر ناقلات لينتيفيروسية وإنتاج جسيمات لينتيفيروسية، ثم البدء بإصابة الخلايا المستهدفة وتكثير المزارع المختارة. بعد ذلك، يتم مراقبة تعبير bioluminescence في الخلايا المراسلة المتزامنة باستخدام جهاز تسجيل مناسب.

في نهاية المطاف، يُستخدم تسجيل التلألؤ البيولوجي لإثبات الإيقاعات اليوماوية ذاتية الخلايا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل عفن التحول العابر والحماية السلالية، في أن دمج الجين يتم بوساطة VIR، مما يوفر دمجاً مستقراً في جينوم الخلايا، فضلاً عن كفاءة وتعددية استخدام أكبر.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث الساعة البيولوجية. على سبيل المثال، هل توجد ساعات بيولوجية خاصة بأنسجة معينة؟ وإذا كان الأمر كذلك، فما هي خصائص الساعات البيولوجية الخاصة بالأنسجة؟

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول آليات الساعة البيولوجية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل ديناميكيات الدورة الخلوية، وتكون الأورام، وما إلى ذلك. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما قررنا دراسة الساعات البيولوجية المحددة لأنواع الخلايا أو الأنسجة.

ستقوم الدكتورة Chita Norm Napkin، زميلة ما بعد الدكتوراه، وساندرا، طالبة الدراسات العليا من مختبري Atory، بشرح الإجراء. عادةً ما يحتوي تركيب المراسل للساعة البيولوجية في الثدييات على كاسيت تعبير يندمج فيه محفز الساعة البيولوجية مع جين luciferase. وفي هذا المراسل الفيروسي البطيء، يكون luciferase غير المستقر تحت تحكم محفز per2 في الفئران.

للحصول على تعليمات مفصلة حول بناء نواقل المراسلة عن طريق تفاعل إعادة الاندماج، يرجى مراجعة المخطوطة المرفقة من أجل عملية ترانسفكشن فعالة. ابدأ بمزرعة من خلايا الكلى الجنينية البشرية ذات عدد ممرات منخفض والتي تكون متلاحمة بنسبة 90 إلى 100%. والآن، سنقوم بطلاء أطباق زراعة ذات ستة آبار.

لإجراء عملية عفن الخلية (transfection)، أضف ملليلتر واحد من poly L lycine بتركيز 0.001% إلى كل بئر، واحضرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، ثم اشطفها مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بحصد الخلايا باستخدام trypsin وزرعها في كل بئر من الأطباق المطلية مسبقاً. قم بتدوير الأطباق لضمان توزيع الخلايا بشكل متساوٍ.

تحقق من وصول الخلايا المستزرعة إلى مرحلة التلاقي بنسبة 80 إلى 90% في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. قم بتحضير خليط ترانسفكشن البلازميد المكون من بلازميد مراسل لعدوى لنتيفيروس، وDNA، وثلاثة ناقلات تغليف كعينة ضابطة لعمليتي الترانسفكشن والعدوى اللاحقة. قم بتضمين بئر إضافي لناقل تعبير GFP لنتيفيروسي يحمل البروتين الفلوري الأخضر المعزز تحت تحكم محفز CMV.

بعد ذلك، أضف 100 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.25 M إلى البلازميدات واخلط جيداً. ثم أضف 100 µL من محلول two XBBS واخلط بلطف ولكن بشكل شامل. قم بتحضين خليط الـ DNA في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

أثناء الانتظار، استبدل الوسط الغذائي لخلايا 2 9 3 T بـ 2 mL من وسط غذائي جديد. أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل لتعادل قيمة pH الوسط. بعد ذلك، أضف مزيج عفن الخلايا (transfection mix) إلى الخلايا تدريجياً على شكل قطرات، وقم بتدوير الطبق برفق وراقب تشكّل الجسيمات تحت المجهر، ثم ضع الخلايا في الحاضنة طوال الليل.

بعد حوالي 16 ساعة من عملية عفن التحول (transfection)، يتم تجديد الوسط بإضافة 2 mL من وسط DMEM الطازج والتحضين طوال الليل. بعد ذلك، ولتقييم كفاءة عفن التحول، يتم تقييم تعبير EGFP في خلايا التحكم في عملية التحول. وتعتبر كفاءة عفن التحول التي تتراوح بين 90 إلى 100% مع تعبير عالٍ لـ EGFP مؤشراً موثوقاً على جودة التحضير الفيروسي.

يتم حصاد الوسط الذي يحتوي على الجزيئات الفيروسية المعدية المفرزة، ثم يُجرى الطرد المركزي لإزالة خلايا 2 9 3 T المتبقية وجمع الطافي المحتوي على الفيروس. في اليوم الثالث، يتم استزراع حوالي 12, 003 من خلايا T three في طبق يحتوي على 12 بئرًا، وتُحضن طوال الليل لتصل نسبة التلاقي إلى 20 إلى 30%، ثم تُفحص الخلايا في اليوم الرابع. وفي اليوم الرابع أيضًا، يُضاف poly brain إلى الوسط المجموع الذي يحتوي على الجزيئات الفيروسية ويُخلط جيدًا باستخدام الماصة.

الآن، قم بشفط الوسط من خلايا T3 الثلاث، وأضف 1 mL من الخليط الفيروسي لكل بئر. تُحضن الخلايا عند 37 °C طوال الليل؛ وبعد غسل الخلايا مرة واحدة بـ PBS، قم بتجديد الوسط وتحضين الخلايا عند 37 °C طوال الليل للتعافي والنمو. وعندما تصبح الخلايا متلاحمة، قم بتقسيم الخلايا واستزراعها طوال الليل في اليوم التالي.

لبدء عملية اختيار الخلايا المصابة، أضف وسطاً غذائياً طازجاً يحتوي على 10 µg/mL من الـ Blasticidin. يجب تحديد تركيز الـ Blasticidin القاتل تجريبياً لكل خط خلوي. قم بتجديد الوسط الغذائي الذي يحتوي على الـ Blasticidin كل يومين إلى ثلاثة أيام لضمان الاستمرار في اختيار الخلايا المقاومة للمضاد الحيوي.

التعبير عن مراسلين الساعة. بعد تكثير مزرعة الخلايا المراسلة المقاومة للبلاستين في أطباق زراعة قطرها 35 مليمتر حتى تصبح متلاصقة، نقوم عادةً بتجهيز ثلاثة أطباق أو أكثر لكل سلالة من الخلايا المراسلة تحت كل حالة لتقييم النمط الظاهري. بعد غسلة واحدة باستخدام PBS، يُضاف DMEM يحتوي على 10 micromolar من forline أو 200 nanomolar من dexamethasone مع التحضين عند 37 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة لمزامنة الخلايا.

ضع الخلايا الآن في وسط تسجيل تم تحضيره حديثاً. غطِّ أطباق المزارع بشرائح تغطية معقمة بمقاس 40 مليمتر، وأحكم إغلاقها باستخدام شحم مفرغ من الهواء لمنع التبخر. ضع الأطباق في جهاز قياس التألق الحيوي lumous cycle luminometer وابدأ قياس التألق الحيوي في الوقت الفعلي.

التسجيل من أجل تسجيل لوحة 96 قديمة. باستخدام جهازي تسجيل GSR، يرجى مراجعة المخطوطة المرفقة. يمكننا بسهولة تسجيل الإيقاع لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام في برنامج تحليل دورة lum.

أولاً، يتم إجراء مطابقة لخط الأساس للبيانات الخام. ثم تُستخدم البيانات بعد طرح خط الأساس للمطابقة مع موجة جيبية وتحديد المعلمات المطلوبة للعينات التي تظهر إيقاعات مستمرة. يمكن تحقيق جودة مطابقة للبيانات تزيد عن 90% بسهولة نظراً لارتفاع السطوع العابر.

التحسس للأعلى وتغيير الوسط. عادةً ما نستبعد دورة البيانات الأولى من تحليلنا لغرض عرض البيانات. قم برسم البيانات الخام مقابل الوقت عند الضرورة.

قم برسم البيانات بعد طرح خط الأساس لمقارنة السعة والطور في كل من عملية عفن الانتقال العابر لخلايا 2 9 3 T وفي عدوى الخطوط الخلوية. وتشير الصور الفلورية للخلايا التي تم نقل الجينات إليها أو تحويلها والتي تعبر عن GFP إلى أن نظام توصيل الجينات بوساطة الفيروسات البطيئة فعال للغاية. وتتكون حلقة التغذية الراجعة الأساسية للساعة البيولوجية من عوامل نسخ تؤثر على عناصر المعزز اليوماوي لإنتاج تعبير جيني إيقاعي.

هنا، تُنتِج أربعة تركيبات مراسلة مختلفة في ثلاث خلايا T three أطواراً متميزة من التعبير عن المراسِل. ويمكن توليد أطوار وسيطة جديدة من خلال التنظيم التآزري لعناصر يوماوية متعددة باستخدام تقنية إسكات الجينات عبر RNAi والمركبات النشطة دوائياً. استخدمت هذه التجربة مقياس الضيائية lum cycle لتسجيل الضيائية الحيوية للخلايا في أطباق بقطر 35 مليمتر في خلايا U2 OS.

استُخدم نظام Irna لتوضيح تأثيرات تثبيط تعبير جينات cry one و cry two. وهنا، استُخدم مقياس لومينومتر تآزري لتسجيل التلألؤ البيولوجي للخلايا، وذلك في طبق يحتوي على 96 بئراً يتضمن ثلاث خلايا مراسلة من نوع T three.

استُخدمت جزيئات RNA لتقييم آثار التثبيط الثلاثي (triune knockdown) على الإيقاعات الخلوية. في هذا المثال، استُخدم نظام UX ومقياس لومينومتر من شركة Tecan لتسجيل التألق الحيوي للخلايا في أطباق 384 بئراً. وبينما يتم اختيار الأطباق كما هو موضح، يمكن للجزيئات الصغيرة استهداف وظيفة البروتين دوائياً وتعطيلها في الإيقاعات الخلوية لخلايا U2 OS المراسلة.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال بيولوجيا الساعة البيولوجية لاستكشاف آليات الساعة والفسيولوجيا في أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لدى المشاهد فهم جيد لكيفية إنشاء خطوط خلوية تقريرية لـ Lucifer ومراقبة الأحجام.

ولا تنسَ أن العمل مع الفيروسات يمكن أن يكون شديد الخطورة، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل استخدام وسائل الحماية الشخصية والتطهير من الفيروسات، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.