جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

يوضح هذا البروتوكول كيفية توليد خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات بكفاءة من أربعة مليلترات من الدم المحيطي. في اليوم صفر، يتم عزل وتوسيع الخلايا أحادية النواة من عينة الدم المحيطي. ثم يتم نقل ناقل إعادة البرمجة الجذعي إلى الخلايا الأولية.

في اليوم التاسع، ابدأ بنقل الخلايا المنقولة جينياً إلى طبقة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر غير النشطة، واستزرعها لمدة ثلاثة أسابيع تقريباً. اختر المستعمرات الشبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) للتوسيع والتوصيف. تظهر نتائج صبغ المناعة الفلورية تعبيراً عن علامات تعدد القدرات مثل SSEA-4 و TRA-1-60 و TRA-1-81.

توضيح الطريقة الفعالة لتوليد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات. يوفر استخدام الناقل الفيروسي المضاد للفيروسات للخلايا الجذعية لتوليد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات عدة مزايا مقارنة بالطرق الحالية الأخرى. ولعل الجانب الأكثر جاذبية هو البساطة العامة لهذا النهج، حيث يتطلب وصولاً سهلاً إلى أنسجة المتبرع، وأقصد بذلك خلايا الدم المحيطي التي يمكن الحصول عليها بسهولة.

تتمثل أهم سمات هذه الطريقة في كفاءة برمجة الخلايا والـجودة التي تتميز بها مستنسخات خلايا IPS الناتجة. ستقوم بتوضيح هذا الإجراء أندريا جانيواري سامر، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري، وسارة روزيل، طالبة دراسات عليا في مختبر جورج ميرفي. جميع الخطوات تتم في اليوم صفر.

اسحب أربعة مليلترات (4 mL) من الدم الطرفي في أنبوب تحضير خلايا "vacutainer" يحتوي على سترات الصوديوم. اقلب الأنبوب من ثماني إلى 10 مرات خلال ساعتين من عملية الجمع. قم بطرد العينة مركزياً عند 1,800 G لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع الخلايا أحادية النواة.

اسحب البلازما باستخدام الماصة، ثم اسحب الطبقة البيضاء (buffy coat)، وهي طبقة الخلايا الموجودة بين الحاجز الهلامي والبلازما. انقل الطبقة البيضاء إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 milliliter، وأكمل الحجم الإجمالي ليصل إلى 10 milliliters باستخدام PBS معقم. اقلب الأنابيب عدة مرات ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 300 G لمدة 15 minutes.

أعد تعليق كتلة الخلايا في 10 milliliters من محلول PBS المعقم، وأجرِ عدّاً للخلايا، ثم انقل من 1 إلى 2 × 10⁶ من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي "كرونيكل" معقم سعة 15 milliliter. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكتلة في 2 milliliters من وسط التوسيع. بعد ذلك، ازرع الخلايا أحادية النواة المعزولة في بئر واحدة من طبق يحتوي على 12 بئراً، واحفظها في حضانة عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide.

اجمع الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي وقم بتجميد مخزونات تحتوي على حوالي 2 × 10⁶ خلية لكل أنبوب في FBS يحتوي على 10% DMSO في اليومين الثالث والسادس. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر واغسل البئر مرة واحدة باستخدام 1 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية QBSF 60، وذلك لجمع الخلايا الملتصقة.

احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في 2 milliliters من em. بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى بئر واحد من طبق 12 Well وأعد المزرعة إلى الحاضنة في اليوم التاسع. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 milliliter واغسل البئر مرة واحدة بـ 1 milliliter من وسط الخلايا الجذعية QB SF 60؛ ولجمع الخلايا الملتصقة، قم بطرد المزرعة مركزياً عند 300 G لمدة 10 minutes.

بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا في 1 mL من وسط EM الطازج الذي يحتوي على 5 µg/mL من poly brain وفيروس lentivirus الخاص بـ STEM بنسبة MOI تتراوح من 1 إلى 10. ثم انقل المعلق إلى بئر واحد من طبق يحتوي على 12 بئراً، وقم بالطرد المركزي بسرعة 2,250 RPM لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة 25 °C. أضف 1 mL إضافياً من وسط EM الطازج الذي يحتوي على 5 µg/mL من poly brain ليصبح المجموع 2 mL من وسط EM، ثم ضع الطبق في حضانة زراعة الخلايا في اليوم 10.

بعد حصاد الخلايا كما هو موضح سابقاً، أعد تعليق كتلة الخلايا في 2 mL من وسط استزراع EM. بالنسبة للخلايا المنقولة في بئر واحد من طبق بـ 12 بئراً في اليوم 11، قم بطلاء آبار طبق بـ 6 آبار بـ 0.1% gelatin، ثم ازرع أرومات ليفية جنينية للفئران غير نشطة بكثافة 2 × 10⁵ خلية لكل بئر في وسط meth. جهز ثلاثة آبار لكل عملية عدوى.

في اليوم التالي، يتم حصاد الخلايا أحادية النواة التي تم نقل الجينات إليها كما هو موضح سابقاً. بعد عملية الطرد المركزي، يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط meth الذي يحتوي على BFGF وحمض الأسكوربيك وعوامل النمو.

الآن، قم بشفط الوسط من طبق MES بمعدل 1 mL من الـ MCs لكل بئر من الـ OFMs. بعد ذلك، أضف 1.5 mL من وسط meth الكامل، ثم قم بطرد طبق الترسيب مركزياً بسرعة 500 RPM عند درجة حرارة 25 °C لمدة 30 دقيقة. ثم يتم الاستنبات عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide لمدة يومين، وذلك بدءاً من اليوم 14 فصاعداً.

قم بتجديد الوسط كل يومين بإضافة 2.5 milliliters من وسط meth الذي يحتوي على 10 nanograms per milliliter من BFGF و 50 micrograms per milliliter من ascorbic acid، ولكن بدون عوامل نمو. وفي حدود اليوم 20، وبمجرد ظهور مستعمرات صغيرة، يتم تغذية الخلايا يومياً بكمية قدرها two milliliters من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بين اليومين 30 و 40. يتم التقاط كل مستعمرة ونقلها إلى آبار فردية في طبق 12 Well plate سبق تحضيره بـ inactivated maths تحتوي على one milliliter من وسط HESC بالإضافة إلى rock inhibitor مع تغذية الخلايا يومياً.

بعد ذلك، وباستخدام 1 mL من وسط HESC الخالي من مثبط الروك، تصبح الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الوحيدة جاهزة الآن للتصبيغ المناعي الفلوري لعلامات تعدد القدرات، وكذلك لاستئصال كاسيت إعادة البرمجة المدمج. خلال هذا البروتوكول، تخضع الخلايا لعدة تغيرات شكلية من P BMCs إلى توليد human I PSCs. في اليوم صفر، يتم استزراع الخلايا أحادية النواة المعزولة من الدم المحيطي في وسط التوسيع بعد تسعة أيام.

يُلاحظ ظهور عناقيد من العنب تشبه تجمعات الخلايا، مما يشير إلى أن الخلايا سليمة وتتكاثر قبل عملية التنقيل. وفي غضون اليوم 21 تقريبًا بعد زراعة الخلايا على MAs، تبدأ المستعمرات في التشكل. وفي اليوم 30، تظهر مستعمرات IPSC المورفولوجيا النموذجية الشبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

يُظهر تحليل التألق المناعي هذا للخلايا السلفية المستحثة (IPCs) التي تم توليدها من خلايا الدم المحيطية وحيدة النواة (pbmc) تعبير مؤشرات تعدد القدرات SSEA four وtrial one 60 وtrial 180 1. كما تُظهر خلايا I PSCs صبغاً إيجابياً للفوسفاتاز القلوي. توضح هذه الصور خطوات توليد خلايا IPCs خالية من الجينات المنقولة عن طريق عفن بلازميد coex الذي يعبر عن إنزيم CRE recombinase وجين مقاومة pur mycin كما هو موصوف في summers etal 2010؛ وبالمقارنة مع خلايا IPCs قبل عملية عفن البلازميد، يُلاحظ حدوث موت خلوي.

بعد يومين من الانتقاء باستخدام purmycin، تظهر مستعمرات جديدة من الخلايا المقاومة بعد حوالي 10 أيام من عملية عفن التحول (transfection). وتؤكد تحليلات Southern blot على المستعمرات المختارة استئصال الجين المنقول؛ حيث تُظهر المسارات 1 و3 و5 و7 وجود الجين المنقول في مستنسخات IPSC قبل الاستئصال. وتغيب هذه النطاقات في المسارات 2 و4 و6 و8 بعد استئصال الجين المنقول. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على توليد خلايا IPS بشرية عالية الجودة، سواء كانت طبيعية أو خاصة بمرض معين، بشكل متسق وقوي من كميات صغيرة من الدم المحيطي لأي فرد.

يبسط هذا النهج عملية برمجة الخلايا لجعله متاحاً على نطاق واسع لمجتمع الخلايا الجذعية. وفي الوقت ذاته، يوفر أساساً لتوليد مجموعات أكثر تجانساً من خطوط الخلايا الجذعية.