مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

تقوم تجربة المجهر الفلوري هذه بتقييم حيوية البكتيريا الفردية المرتبطة بالخلايا المضيفة وتحديد الحيوية البكتيرية في مواقع مختلفة داخل الخلية. أولاً، لتحديد البكتيريا الخارجية، يتم تعريض الخلايا المصابة لكاشف فلوري متخصص في بروتين البيرمياز البكتيري، ثم تعريض المضيف المصاب لوجود صبغات فلورية تميز بين البكتيريا الحية وغير الحية بناءً على سلامة الغشاء البكتيري. بعد ذلك، ولتحديد مواقع وجود البكتيريا داخل الخلايا المضيفة، يتم تحضين الخلايا المصابة مع جسم مضاد مقترن فلورياً بعلامة محددة ذات أهمية.

يمكن لصور التألق المناعي الناتجة تحديد النسبة المئوية للبكتيريا الحية داخل الخلايا المضيفة وخارجها، والتوطين تحت الخلوي للبكتيريا داخل الخلوية الحية مقابل غير الحية. وبخلاف مقايسات عد المستعمرات، ومقايسات الحماية بالجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني، تتيح هذه الطريقة التقييم المباشر لحيوية البكتيريا الفردية. كما يمكنها الكشف عما إذا كانت البكتيريا الموجودة في مقصورات تحت خلوية مختلفة تظهر اختلافات في حيويتها.

ستقوم بريتاني جونسون، طالبة الدراسات العليا من مختبري، بشرح هذا الإجراء. بالنسبة للخلايا المستزرعة على أغطية زجاجية دائرية في أطباق تحتوي على 24 بئراً، أضف البكتيريا المراد دراستها واتركها للحضن للمدة المطلوبة. اشطف الخلايا المصابة مرة واحدة برفق. ثم أضف أجساماً مضادة مقترنة بـ Alexa Fluor 647، أو ليكتين خاص بالبكتيريا للكشف عن البكتيريا الخارجية، واتركها للحضن لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد عمليتي شطف، قم بسحب الوسط وإضافة 0.5 milliliters من محلول صبغ الخلايا الحية والميتة الذي يحتوي على cyto nine و propidium iodine. قم بتحضين الخلايا لمدة 15 minutes في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم اشطفها مرتين في mops magnesium chloride. اقلب شرائح التغطية بحيث يكون الوجه السفلي ملامساً للشرائح الزجاجية.

يتم الختم باستخدام طلاء أظافر شفاف. يتم التقاط الصور في غضون 30 دقيقة باستخدام مجهر فلوريسنت مع مجموعات المرشحات الموضحة في البروتوكول النصي لوسم البكتيريا. أضف 10 micrograms per milliliter من DPI في وسط mors المحدد، ثم يتم التحضين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

قم الآن بإصابة الخلايا الملتصقة بالبكتيريا الموسومة بـ DPI. لا تقم بتثبيت الخلايا باستخدام الألدهيدات أو المذيبات العضوية. اشطف الخلايا مرة واحدة.

ثم أضف الجسم المضاد أو الليكتين المقترن بـ Alexa Fluor 6 4, 7 واحضن العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وبعد غسلها مرتين بمحلول MOPS المنظم، أضف جسماً مضاداً مقترناً بـ Alexa Fluor 5 5, 5 ضد المؤشر تحت الخلوي المطلوب واحضن العينة لمدة 20 دقيقة. وبعد غسلها مرتين بمحلول MOPS المنظم، اغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول MOPS وكلوريد المغنيسيوم. ثم اسحب الوسط وأضف 0.4 µM من cyt green واحضن الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم اغسل الخلايا مرتين بمحلول MOPS وكلوريد المغنيسيوم.

ثم اغسل الخلايا. مرة أخرى في محلول mops magnesium chloride لمدة خمس دقائق. اقلب شرائح الغطاء بحيث يكون الوجه لأسفل على شرائح زجاجية، وأغلقها باستخدام طلاء أظافر شفاف، ثم التقط صوراً للشرائح في غضون 30 دقيقة باستخدام المجهر الفلوري.

في هذه التجربة، تم إصابة الخلايا المتعادلة البشرية ببكتيريا السيلان. يقوم ليكتين الصويا المقترن بـ Alexa Fluor 647 بالكشف عن بكتيريا السيلان خارج الخلوية. بعد ذلك، تمت إضافة صبغة الحيوية الفلورية الخضراء، ويوديد البروبيديوم الفلوري الأحمر بوجود السابونين، الذي يعمل على عزل الكوليسترول لنفاذ أغشية البلازما للخلايا المضيفة بشكل تفضيلي، ولكنه لا ينفذ عبر غشاء بكتيريا السيلان في الخلايا المصابة، بينما تُصبغ نواة الخلية حقيقية النواة بكل من cyto nine ويوديد البروبيديوم.

تم توليد هذه الصور للخلايا المتعادلة المصابة بالسيلان باستخدام صبغات الحيوية cyt talk screen و dpi. لم يتم استخدام صبغة يوديد البروبيديوم لأنها تومض في كل من القنوات الحمراء وفوق البنفسجية في المجهر الفلوري. تصطبغ جميع بكتيريا السيلان بصبغة dpi، ولكن البكتيريا ذات الأغشية التالفة فقط هي التي تصطبغ بـ ox green.

تظهر البكتيريا غير القابلة للحياة داخل الخلايا حلقة من صبغ CD 63 تحيط بالبكتيريا. وتشير هذه الحلقة إلى أن الحبيبات الأولية تتركز في هذا الجسيم البلعمي. أما البكتيريا القابلة للحياة داخل الخلايا، فهي تفتقر إلى صبغ CD 63، مما يشير إلى أن الحبيبات الأولية لا تتركز في الجسيم البلعمي الخاص بها.

تُظهر البيانات مجتمعةً وجود علاقة ارتباط بين حيوية بكتيريا السيلان (gonorrhea) وتواجدها في جسيم بلعمي سالب الحبيبات الأولية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم حيوية البكتيريا داخل الخلايا المضيفة. بالإضافة إلى ذلك، ستتمكن من تحديد حيوية البكتيريا المتموضعة في مقصورات مختلفة داخل الخلايا المضيفة باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد هذه المقصورات تحت الخلوية.