مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

تقوم تجربة الفحص المجهري الفلوري هذه بتقييم جدوى البكتيريا الفردية المرتبطة بالخلايا المضيفة وتحديد صلاحية البكتيريا في مواقع مختلفة تحت الخلايا. أولا ، لتحديد البكتيريا الخارجية ، قم بتعريض الخلايا المصابة لكاشف فلوري خاص بنفاذية البكتيريا ، المضيف المصاب في وجود أصباغ فلورية تميز البكتيريا القابلة للحياة عن البكتيريا غير القابلة للحياة بناء على سلامة الغشاء البكتيري. ثم للإشارة إلى مكان وجود البكتيريا داخل الخلايا المضيفة ، احتضان الخلايا المصابة بجسم مضاد مقترن بالفلورسنت لعلامة الاهتمام.

يمكن أن تحدد الصور المناعية الناتجة النسبة المئوية للبكتيريا القابلة للحياة داخل الخلايا المضيفة وخارجها ، وتوطين الخلايا تحت الخلايا للبكتيريا داخل الخلايا القابلة للحياة مقابل غير القابلة للحياة. على عكس فحوصات عدد المستعمرات ، ومقايسات حماية الجنتاميسين ، والفحص المجهري الإلكتروني ، تسمح هذه الطريقة بالتقييم المباشر لصلاحية البكتيريا الفردية. يمكن أن يكشف أيضا ما إذا كانت البكتيريا الموجودة في مقصورات تحت الخلايا المختلفة لها اختلافات في قابليتها للحياة.

وسيتم إثبات هذا الإجراء بريتاني جونسون, طالبة دراسات عليا من مختبري, Atory للخلايا المزروعة على غطاء زجاجي دائري زلات في 24, لوحات جيدا تضيف البكتيريا ذات الأهمية وتحتضن للوقت المطلوب. اشطف الخلايا المصابة مرة واحدة برفق. ثم أضف الجسم المضاد المقترن Alexa Fluor 6 4 7 ، أو ليكتين بكتيري خاص للكشف عن البكتيريا الخارجية واحتضانه لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد شطفتين ، استنشق الوسائط وأضف 0.5 مل من محلول تلطيخ الميت الحي الذي يحتوي على سيتو تسعة وبروبيديوم يود. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم اشطفها مرتين في مماسح كلوريد المغنيسيوم. اقلب الغطاء ووجهه لأسفل على شرائح زجاجية.

ختم بطلاء أظافر شفاف. احصل على الصور في غضون 30 دقيقة باستخدام مجهر فلوري مع مجموعات مرشحات مفصلة في بروتوكول النص لتسمية البكتيريا. أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من DPI في وسط محدد واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

الآن تصيب الخلايا الملتصقة بالبكتيريا المسماة DPI. لا تصلح الخلايا بالألدهيدات أو المذيبات العضوية. اشطف الخلايا مرة واحدة.

ثم أضف Alexa Fluor 6 4 أو 7 أجسام مضادة مقترنة أو ليكتين واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد شطفتين باستخدام المخزن المؤقت للمماسح ، أضف جسما مضادا مقترنا Alexa Fluor 5 5 ، 5 ضد علامة تحت الخلية ذات الأهمية واحتضانه لمدة 20 دقيقة بعد دقيقتين ، RINs مع مخزن مؤقت للمماسح ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مماسح كلوريد المغنيسيوم. ثم استنشق الوسائط وأضف 0.4 ميكرومولار الخلايا الخضراء المحتضنة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، وقم بتحريك الخلايا مرتين في المماسح ، وكلوريد المغنيسيوم.

ثم اغسل الخلايا. مرة أخرى في ممسحة كلوريد المغنيسيوم لمدة خمس دقائق. اقلب زلقات الغطاء ووجهها لأسفل على ختم الشرائح الزجاجية بطلاء أظافر شفاف ، واحصل على صور للشرائح في غضون 30 دقيقة على المجهر الفلوري.

في هذه التجربة ، أصيبت العدلات البشرية بمرض السيلان. يكتشف ليكتين فول الصويا المقترن ب Alexa Fluor 6 4 7 السيلان خارج الخلية. ثم تموت قابلية الفلورسنت الخضراء للبقاء ، وأضيف يوديد البروبيديوم الفلوري الأحمر في وجود الصابونين ، الذي يعزل الكوليسترول ليخترض أغشية بلازما الخلية المضيفة بشكل تفضيلي ، ولكنه لا يتخلل غشاء السيلان في الخلايا المصابة ، وتبقع نواة الخلية حقيقية النواة مع كل من سيتو تسعة ويوديد البروبيديوم.

تم إنشاء هذه الصور للعدلات المصابة بالسيلان باستخدام أصباغ البقاء cyt و talk screen و dpi. لم يتم استخدام صبغة يوديد البروبيديوم لأنها تتألق في كل من القنوات الحمراء والأشعة فوق البنفسجية على المجهر الفلوري. جميع بقع السيلان مع نقطة في البوصة ، ولكن فقط البكتيريا ذات الأغشية المعرضة للخطر تلطخ باللون الأخضر الثوري.

تحتوي البكتيريا داخل الخلايا غير القابلة للحياة على حلقة من تلطيخ CD 63 المحيطة بالبكتيريا. تشير هذه الحلقة إلى إثراء الحبيبات الأولية في هذا البلعمة. تفتقر البكتيريا داخل الخلايا القابلة للحياة إلى تلطيخ CD 63 مما يشير إلى عدم إثراء الحبيبات الأولية عند البلعمة. اتخذت.

البيانات معا وجود علاقة بين بقاء مرض السيلان والمقيمين في البلعمة السلبية للحبيبات الأولية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم صلاحية البكتيريا في الخلايا المضيفة. بالإضافة إلى ذلك ، ستتمكن من تحديد صلاحية البكتيريا الموضعية في مقصورات مختلفة في الخلايا المضيفة باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد هذه المقصورات تحت الخلوية.