مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات
سبتمبر 5, 2013
المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.
تقوم تجربة الفحص المجهري الفلوري هذه بتقييم جدوى البكتيريا الفردية المرتبطة بالخلايا المضيفة وتحديد صلاحية البكتيريا في مواقع مختلفة تحت الخلايا. أولا ، لتحديد البكتيريا الخارجية ، قم بتعريض الخلايا المصابة لكاشف فلوري خاص بنفاذية البكتيريا ، المضيف المصاب في وجود أصباغ فلورية تميز البكتيريا القابلة للحياة عن البكتيريا غير القابلة للحياة بناء على سلامة الغشاء البكتيري. ثم للإشارة إلى مكان وجود البكتيريا داخل الخلايا المضيفة ، احتضان الخلايا المصابة بجسم مضاد مقترن بالفلورسنت لعلامة الاهتمام.
يمكن أن تحدد الصور المناعية الناتجة النسبة المئوية للبكتيريا القابلة للحياة داخل الخلايا المضيفة وخارجها ، وتوطين الخلايا تحت الخلايا للبكتيريا داخل الخلايا القابلة للحياة مقابل غير القابلة للحياة. على عكس فحوصات عدد المستعمرات ، ومقايسات حماية الجنتاميسين ، والفحص المجهري الإلكتروني ، تسمح هذه الطريقة بالتقييم المباشر لصلاحية البكتيريا الفردية. يمكن أن يكشف أيضا ما إذا كانت البكتيريا الموجودة في مقصورات تحت الخلايا المختلفة لها اختلافات في قابليتها للحياة.
وسيتم إثبات هذا الإجراء بريتاني جونسون, طالبة دراسات عليا من مختبري, Atory للخلايا المزروعة على غطاء زجاجي دائري زلات في 24, لوحات جيدا تضيف البكتيريا ذات الأهمية وتحتضن للوقت المطلوب. اشطف الخلايا المصابة مرة واحدة برفق. ثم أضف الجسم المضاد المقترن Alexa Fluor 6 4 7 ، أو ليكتين بكتيري خاص للكشف عن البكتيريا الخارجية واحتضانه لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
بعد شطفتين ، استنشق الوسائط وأضف 0.5 مل من محلول تلطيخ الميت الحي الذي يحتوي على سيتو تسعة وبروبيديوم يود. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم اشطفها مرتين في مماسح كلوريد المغنيسيوم. اقلب الغطاء ووجهه لأسفل على شرائح زجاجية.
ختم بطلاء أظافر شفاف. احصل على الصور في غضون 30 دقيقة باستخدام مجهر فلوري مع مجموعات مرشحات مفصلة في بروتوكول النص لتسمية البكتيريا. أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من DPI في وسط محدد واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
الآن تصيب الخلايا الملتصقة بالبكتيريا المسماة DPI. لا تصلح الخلايا بالألدهيدات أو المذيبات العضوية. اشطف الخلايا مرة واحدة.
ثم أضف Alexa Fluor 6 4 أو 7 أجسام مضادة مقترنة أو ليكتين واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد شطفتين باستخدام المخزن المؤقت للمماسح ، أضف جسما مضادا مقترنا Alexa Fluor 5 5 ، 5 ضد علامة تحت الخلية ذات الأهمية واحتضانه لمدة 20 دقيقة بعد دقيقتين ، RINs مع مخزن مؤقت للمماسح ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مماسح كلوريد المغنيسيوم. ثم استنشق الوسائط وأضف 0.4 ميكرومولار الخلايا الخضراء المحتضنة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، وقم بتحريك الخلايا مرتين في المماسح ، وكلوريد المغنيسيوم.
ثم اغسل الخلايا. مرة أخرى في ممسحة كلوريد المغنيسيوم لمدة خمس دقائق. اقلب زلقات الغطاء ووجهها لأسفل على ختم الشرائح الزجاجية بطلاء أظافر شفاف ، واحصل على صور للشرائح في غضون 30 دقيقة على المجهر الفلوري.
في هذه التجربة ، أصيبت العدلات البشرية بمرض السيلان. يكتشف ليكتين فول الصويا المقترن ب Alexa Fluor 6 4 7 السيلان خارج الخلية. ثم تموت قابلية الفلورسنت الخضراء للبقاء ، وأضيف يوديد البروبيديوم الفلوري الأحمر في وجود الصابونين ، الذي يعزل الكوليسترول ليخترض أغشية بلازما الخلية المضيفة بشكل تفضيلي ، ولكنه لا يتخلل غشاء السيلان في الخلايا المصابة ، وتبقع نواة الخلية حقيقية النواة مع كل من سيتو تسعة ويوديد البروبيديوم.
تم إنشاء هذه الصور للعدلات المصابة بالسيلان باستخدام أصباغ البقاء cyt و talk screen و dpi. لم يتم استخدام صبغة يوديد البروبيديوم لأنها تتألق في كل من القنوات الحمراء والأشعة فوق البنفسجية على المجهر الفلوري. جميع بقع السيلان مع نقطة في البوصة ، ولكن فقط البكتيريا ذات الأغشية المعرضة للخطر تلطخ باللون الأخضر الثوري.
تحتوي البكتيريا داخل الخلايا غير القابلة للحياة على حلقة من تلطيخ CD 63 المحيطة بالبكتيريا. تشير هذه الحلقة إلى إثراء الحبيبات الأولية في هذا البلعمة. تفتقر البكتيريا داخل الخلايا القابلة للحياة إلى تلطيخ CD 63 مما يشير إلى عدم إثراء الحبيبات الأولية عند البلعمة. اتخذت.
تظهرالبيانات معا وجود علاقة بين بقاء مرض السيلان والمقيمين في البلعمة السلبية للحبيبات الأولية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم صلاحية البكتيريا في الخلايا المضيفة. بالإضافة إلى ذلك ، ستتمكن من تحديد صلاحية البكتيريا الموضعية في مقصورات مختلفة في الخلايا المضيفة باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد هذه المقصورات تحت الخلوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تحدد هذه المقالة البروتوكولات لتقييم قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا الفردية المرتبطة بالخلايا المضيفة باستخدام مجهر الفلورة. تسمح الطرق المفصلة بتحديد قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا في مواقع تحت خلوية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التسبب البكتيري
- مجهر الفلورة
- التفاعلات الخلوية
الخلفية
- فهم بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة أمر بالغ الأهمية لدراسة العدوى.
- يمكن للأصباغ الفلورية التمييز بين البكتيريا الحية وغير الحية.
- قد لا توفر الطرق التقليدية تقييمات مباشرة لقابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا الفردية.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين فهم سلوك البكتيريا داخل الخلايا المضيفة.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة لتقييم قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا في الخلايا المضيفة.
- لاستكشاف توطين البكتيريا الحية مقابل البكتيريا غير الحية.
- لتوفير بديل أكثر دقة لطرق تقييم البقاء على قيد الحياة الحالية.
الطرق المستخدمة
- تعرض الخلايا المصابة لعوامل كيميائية فلورية محددة لنفاذية البكتيريا.
- استخدام الأصباغ الفلورية لتمييز البكتيريا الحية عن غير الحية.
- الحضانة مع أجسام مضادة مرتبطة بالفلورسنت لتحديد مواقع البكتيريا.
- تحليل الصور المناعية الفلورية لتحديد قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا.
النتائج الرئيسية
- تسمح الطريقة بتقييم مباشر لقابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا الفردية.
- تشير النتائج إلى وجود اختلافات في القابلية للبقاء على قيد الحياة بناءً على التوطين تحت الخلوي.
- توفر التصوير المناعي الفلورية تصورًا واضحًا للبكتيريا.
- يفوق هذا النهج الطرق التقليدية في تقييم قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا.
الاستنتاجات
- الطريقة التي تم تطويرها فعالة لدراسة قابلية البقاء على قيد الحياة للبكتيريا في الخلايا المضيفة.
- يمكن أن يكشف مجهر الفلورة عن رؤى مهمة حول التسبب البكتيري.
- تعزز هذه الدراسة فهم استراتيجيات بقاء الميكروبات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
