استيعاب ومراقبة من نيون جزيئات حيوية في الكائنات الدقيقة الحية عبر Electroporation لل

دراسات الجزيئات الحيوية في الجسم الحي ضرورية لفهم الوظيفة الجزيئية في السياق البيولوجي. نصف هنا طريقة جديدة تسمح باستيعاب الجزيئات الحيوية الفلورية ، مثل الحمض النووي أو البروتينات ، في الكائنات الحية الدقيقة الحية. كما يتم تقديم ومناقشة تحليل البيانات في الجسم الحي المسجلة بواسطة الفحص المجهري الفلوري.

الهدف من هذا الإجراء هو استيعاب وتصور الجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي أو البروتينات المسماة بالفلور العضوي داخل الكائنات الحية الدقيقة باستخدام طريقة تعتمد على التثقيب الكهربائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان الخلايا المختصة بالكهرباء أولا بجزيئات حيوية مصنفة بالفلورسنت قبل نقلها إلى فطرة التثقيب الكهربائي. من خلال تطبيق جهد عال عبر تكوينات المسام العابرة على كل من جدار الخلية وغشاء الخلية ستمكن من الانتشار الجزيئي الحيوي في الخلايا.

بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا في وسط غني للسماح لها بالتعافي قبل إزالة الجزيئات الحيوية الزائدة غير الداخلية. أخيرا ، يتم نقل الخلايا إلى وسادة نشأة منخفضة الفلورة من المغذيات ، ثم يتم تراكب زلة غطاء زجاجي في الأعلى لتشكيل شطيرة زراعية زجاجية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري للجوهر لتحليل الموقع ونمط الانتشار والخصائص الديناميكية للجزيئات الحيوية المسماة داخل الخلايا الحية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا القيود في تصوير الخلايا الحية. نظرا للخلل السريع في بروتينات الفلورسنت الضوئية مثل GFP ، استنتجنا أنه من خلال تحميل الخلايا الحية بجزيئات حيوية مصنفة بقوة الفلورو العضوية ، سنقوم بزرعها في الكائنات الحية الدقيقة. المزايا الرئيسية لهذه القوة وهي السطوع واستقرار الصورة وصغر الحجم.

نأمل بعد ذلك في متابعة توطين وانتشار الحمض النووي أو البروتينات في بيئاتها الأصلية على نطاقات زمنية أطول بكثير ، والتي من شأنها أن تتطابق مع العديد من العمليات البيولوجية المهمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات على الطرق الحالية ، مثل الحقن المجهري ، هي أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأصغر من قطر إبرة الحقن المجهري النموذجية. تتمثل إحدى المزايا الإضافية للتثقيب الكهربائي في أنه يمكن تحميل عدد كبير من الخلايا في نفس الوقت بجزيئات حيوية فلورية وتصورها بالتوازي مع تلك التي تجعل التثقيب الكهربائي تقنية إنتاجية العين بشكل خاص.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسلوك الانتشار والديناميكيات للجزيئات الحيوية المصنفة فلورسنت في الجسم الحي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في سياقات أخرى مثل الجزيئات الحيوية للأقطاب الكهربائية التي لم يتم تصنيفها ، ولكن يمكنها ، على سبيل المثال ، أن تؤدي إلى استجابة فسيولوجية عند استيعابها بواسطة الخلية لبناء وسادات aros للبكتيريا أو الخميرة يبدأ المجهر الفلوري بإعداد بعض وسائط مضان منخفضة ، ثم قم بإذابة محلول 2٪ من aros في الماء المقطر باستخدام ميكروويف المختبر على الفور. أضف حجما واحدا مطابقا من وردة HA الساخنة إلى الوسائط وقم بسحب الخليط برفق لأعلى ولأسفل. تجنب تكوين الفقاعات على الفور ، قم بوضع ماصة ما يقرب من 200 ميكرولتر من الخليط المنشأ على زلة غطاء مجهر ذات حجم قياسي.

اترك الغطاء ينزلق على المقعد لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمد الجل أو قم بالتخزين المؤقت ضع غطاء نظيفا ثانيا ينزلق فوق الوسادة الطازجة واضغط برفق من الأعلى على وردة البيض ، بدءا من مخزون من الجزيئات الحيوية الفلورية المحضرة في مخزن مؤقت منخفض القوة الأيونية. انقل ما يصل إلى خمسة ميكرولترات من الجزيئات الحيوية إلى 20 ميكرولترا من البكتيريا المختصة ، أو 50 ميكرولترا من خلايا الخميرة المختصة. ترتبط كمية الجزيئات الحيوية الفلورية المحتضنة بالخلايا ارتباطا مباشرا بكمية الجزيئات الحيوية الداخلية لكل خلية.

بعد التثقيب الكهربائي ، احتضن الخليط على الثلج لمدة تصل إلى 10 دقائق. في الوقت نفسه ، حدد جهاز التثقيب الكهربائي لتباعد الأقطاب الكهربائية المناسب وقم بالبرد على الجليد. انقل خليط الخلية إلى البيطر المبرد مسبقا.

اضغط برفق على vete عدة مرات لإزالة أي فقاعات من المحلول. قم بإزالة أي رطوبة من vete بمنشفة ورقية وضع vete في الكهربائي. قم بتطبيق نبضة عالية الجهد على الخلايا بعد هذه العملية مباشرة.

تحقق من أن ثابت الوقت المعروض على الماتور الكهربائي يتراوح بين أربعة وستة أجزاء من الثانية. غالبا ما تكون الثوابت الزمنية المنخفضة ناتجة عن وجود ملح أو فقاعات زائدة داخل qve ، وقد تقلل أو تمنع تماما امتصاص الجزيئات الحيوية في الخلايا. تعمل نبضات الجهد العالي على تحسين تحميل الخلية ، ولكنها يمكن أن تؤثر أيضا على بقاء الخلية مباشرة بعد التثقيب الكهربائي.

أضف 500 ميكرولتر من الوسائط الغنية وانقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. دع غشاء الخلية يتعافى عن طريق احتضان البكتيريا التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية أو الخميرة 29 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق. بعد دمج الجزيئات الحيوية واستعادة النمو ، قم بتدوير الخلايا لمدة دقيقة واحدة في أربع درجات مئوية وتخلص من عامل Reese المستلق.

قم بتعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت وكرر عمليات الدوران والإزالة وتعليق إعادة التحميل العازلة. ثلاث مرات أخرى. ستزيل خطوات الغسيل هذه جميع آثار الجزيئات الحيوية غير الداخلية من تعليق الخلية.

في حالة الاستيعاب وخطوة التنقية الإضافية للبروتين المسمى ، يتم تنفيذ عملية سحب معلق الخلية في أنبوب سعة 1.5 مليلتر مزود بمرشح غشاء 0.22 ميكرون في الأعلى. افصل الخلايا عن المخزن المؤقت عن طريق الطرد المركزي مع التأكد من وجود سائل كاف فوق المرشح لتجنب جفاف الخلايا والتخلص من التدفق عبر الكسر. أسفل الفلتر ، أضف 500 ميكرولتر من PBS الطازج فوق الخلايا وكرر مزيج الدوران لأسفل متبوعا بإصدار PBS جديد.

مرتين أخريين. قم بإجراء دورة نهائية عند 3 ، 300 جم لمدة دقيقة واحدة. لإزالة غسل PBS السابق ، أعد تعليق الخلايا ب 150 ميكرولتر من PBS.

أخيرا ، قم بإزالة زلة الغطاء العلوي من وسادة aros المصنوعة مسبقا. قم بتحميل الخلايا على الوسادة عن طريق سحب 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بالتنقيط. بعد وضع زلة غطاء جديدة نظيفة أعلى وسادة الارتفاض ، أصبحت خلايا الساندويتش جاهزة الآن للفحص المجهري الفلوري.

أيضا تحضير الضوابط السلبية مثل الضوابط غير المصنفة ، والتي تم احتضانها بجزيئات حيوية مصنفة أو خلايا فارغة ، والتي لم يتم تصنيفها كهربائيا أو احتضانها ، بالتوازي مع أي عينات محملة ، ويمكن تصوير الخلايا المحملة على أي مجهر مضان مناسب. بينما يسمح وضع التصوير الواسع المجال بالتصوير والتحليل على مستوى الخلية ، أو العشب أو الإضاءة المنخفضة العالية أو الأمثل لمراقبة الجزيء الفردي وتتبعه. لمنع التبييض الضوئي الزائد للجزيئات الحيوية ، يرجى التأكد من إيقاف تشغيل جميع مصابيح الليزر الموجودة على المسرح أو حظرها باستخدام مرشح غير شفاف قبل تحميل العينة.

علاوة على ذلك، قم بإيقاف تشغيل كسب الكاميرا E-M-C-C-G لمنع تلف الكاميرا الناتج عن التعريض الضوئي الزائد. لإعداد المجهر المقلوب ، ضع شطيرة وسادة Aris على مرحلة المجهر بحيث يكون الجانب المغطى بالخلية متجها لأسفل باتجاه الهدف السفلي. ثم قم بتشغيل ضوء الهالوجين الجانبي العلوي وقم بتركيز الخلايا تحت وضع الفحص المجهري للضوء الأبيض المرسل قبل تشغيل الليزر ، والتقط صورة للخلايا تحت وضع نقل الضوء الأبيض.

سيتم استخدام هذه الصورة كخريطة مرجعية موضعية ترتبط بين مناطق التألق الجزيئي الحيوي بالمواقع الفعلية للخلايا داخل نفس مجال الرؤية. لقياس الجدوى ، استخدم سخان موضوعي مضبوطة على درجة الحرارة المثلى وسجل صورا متسلسلة لنفس مجال الرؤية تحت إضاءة الضوء الأبيض كل 30 دقيقة دون تحريك المسرح ، وقم بإيقاف تشغيل الإضاءة العلوية العلوية وحماية عينتك من جميع مصادر الإضاءة المحيطة الأخرى في المختبر. ثم قم بتشغيل كاميرا CCD وابدأ في الحصول على البيانات.

ابدأ في تسجيل أيون الفلورسنت قبل تشغيل إضاءة الليزر مباشرة. بعد إجراء الفحص المجهري الفلوري ، ابدأ تحليل البيانات عن طريق فتح جميع الصور باستخدام برنامج معالجة الصور مثل Image J لبدء تطبيع جميع معلمات الصورة الأساسية مثل السطوع أو التباين عبر جميع الصور بالضغط على زر الضبط وتحديد النشر لجميع الصور الأخرى. يمكن للخيار الأول التأكد نوعيا مما إذا كان تحميل الخلية ناجحا حيث يجب أن تكون الخلايا المحملة أكثر إشراقا بشكل ملحوظ من الخلايا غير المثقبة بالكهرباء المستخدمة كعنصر تحكم سلبي لصورة معينة.

استخدم أداة الاختيار اليدوي المجانية وقم بتطويق مناطق مختلفة من التألق بمضلعات مرسومة يدويا. قارن شدة التألق بين جميع المضلعات ذات الصلة عن طريق اختيار خيار القياس من قائمة التحليل. كرر هذه العملية يدويا أو باستخدام برنامج نصي آلي لاستخراج الكثافة لكل بكسل لجميع الخلايا في كل عينة وعناصر التحكم السلبية.

عندما يتم تحميل خلية مصنفة كهربائيا بواحد أو أكثر من الجزيئات الحيوية الفلورية ، فإن متوسط شدة انبعاثها سيكون أكبر من متوسط شدة عينة التحكم السلبية. لتقييم صلاحية الخلية ، احسب يدويا النسبة المئوية للقسمة السليمة على الخلايا غير المنقسمة والتالفة. في نفس مجال الرؤية الذي تم تسجيل البيانات الخاصة به كل 30 دقيقة على عدة أقسام ، ليس من الممكن دائما حساب عدد الجزيئات الحيوية الداخلية لكل خلية مباشرة ، خاصة عندما تنتشر الجزيئات الحيوية بسرعة أو عندما يتم تحميل الخلايا بأكثر من خمسة جزيئات حيوية مصنفة.

يسمح تحليل التبييض الضوئي القائم على الخلايا بتقييم عدد الجزيئات الحيوية المصنفة لكل خلية في مثل هذه الظروف. باستخدام زر التحديد اليدوي ، تتبع الخطوط العريضة لخلية فلورية معينة واستخرج وترسم مضان الخلية الخام كدالة للوقت بسبب تأثيرات التبييض الضوئي. سيكون الرسم البياني للكثافة مقابل الوقت منحنى متناقصا بشكل كبير ، الخلايا المحملة بشدة ، ولكن بالنسبة للخلايا التي تحتوي على أقل من 10 جزيئات حيوية ، يجب تمييز الخطوات الواضحة.

احسب متوسط التألق الذاتي بعد التبييض الضوئي عن طريق حساب متوسط قيم شدة الفلورسنت الخام بالقرب من جزء نهاية الذيل المسطح من التجربة ، والتي يمكن أن تكون ، على سبيل المثال ، من آخر 50 إلى 100 إطار للصور في سلسلة الفاصل الزمني. بعد تحديد شدة خط الأساس أيضا ، احسب شدة التبييض الضوئي المعتمدة على الوقت عن طريق طرح التألق الذاتي الأساسي من بيانات التألق الخام ، ثم قم بحظر بيانات شدة التبييض الضوئي الناتجة وحدد ارتفاع كل خطوة يدويا أو باستخدام خوارزمية. يجب تكرار هذه العملية للعديد من الخلايا التي تظهر أكثر من 100 خطوة بشكل عام من أجل الحصول على تقدير دقيق لمتوسط ارتفاع الخطوة ، وتتوافق هذه القيمة مع شدة الفلورو الوحدوية الأربعة بسبب تبييض أربعة فلورو واحد.

أخيرا ، يمكن حساب عدد الجزيئات الداخلية لكل خلية بقسمة شدة الخلية المطروحة في الوقت المناسب تساوي صفرا على الفلورو الوحدوي. أربعة شدة لبروتوكول التثقيب الكهربائي هذا. يمكن التحكم في كمية الحمض النووي أو البروتين المسمى بالفلورسنت والذي يمكن استيعابه في بكتيريا أو خميرة عن طريق ضبط كمية مجسات الحمض النووي الموجودة داخل المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي.

عندما يكون معدل الاستيعاب الجزيئي الحيوي مرتفعا ، فإن عمر التبييض الضوئي للجزيء الحيوي المسمى ، والذي يمكن العثور عليه عن طريق رسم شدة الفلورسنت أولا كدالة للوقت ثم استخراج ثابت الوقت الأسي يعطي معلومات حول استقرار الصورة للأصباغ في الجسم الحي. في حالة انخفاض معدلات الدمج ، سيوفر تكميم شدة الفلورسنت وسيلة لتقريب العدد الإجمالي للجزيئات الحيوية داخل خلية معينة. يمكن أيضا استخدام التثقيب الكهربائي لدمج البروتينات في البكتيريا أو الخميرة.

في حالة البروتين المسمى بالفلورسنت. نظرا لأنه يمكن استيعاب الفلوروفورات الحرة نفسها بكفاءة عالية ، فمن المهم إزالة جميع الفلوروفورات الزائدة الحرة وغير المرتبطة تساهمية من مخزون البروتين. أخيرا ، يمكن أيضا استيعاب جزيئاتنا المصابة بشكل مضاعف باستخدام طريقتنا للسماح بمراقبة حنق الجزيء الفردي في الخلايا الحية على مدى عدة ثوان.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أيضا إعداد وتحليل عينات التحكم مثل الخلايا غير الكهربائية ، والتي يتم احتضانها بجزيء حيوي مسمى أو خلايا فارغة ، والتي لا يتم تكوينها كهربائيا أو تحضنها بجزيء مسمى. تسمح لنا هذه الضوابط بتقييم مستوى التألق الذاتي للخلية ونقص خطوات الغسيل ، وبالتالي فهي ضرورية لتقييم ما إذا كانت تجربة التثقيب الكهربائي ناجحة بعد تطوراتها. فتحت هذه التقنية طرقا جديدة للباحثين في مجال الفيزياء الحيوية وعلم الأحياء الثالث لاستكشاف الانتشار والسلوك الديناميكي للجزيء الحيوي الملصق في الكائنات الحية الدقيقة.

وهذا على المقياس الزمني أطول من واحد إلى ترتيبين من حيث الحجم مقارنة بالبروتينات الفلورية الذاتية مثل GFPs. لقد نقلت مرونة وضع العلامات العضوية d في الجسم الحي مما جعل تجارب تهديد الجزيء الفردي أكثر جدوى لدراسة الديناميكيات داخل الجزيئات وبين الجزيئات في الخلايا الحية.