باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate الكلاميديا فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد ديناميكيات نمو الاندماج الكلاميديا في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الخلايا المضيفة الفلورية أولا التي تعبر بثبات عن بروتين فلوري مثل GFP في السيتوبلازم. بعد ذلك ، تصاب الخلايا المضيفة بالكلاميديا ويسمح لها بالحضانة.

ثم يتم تصور الخلايا المصابة عن طريق الفحص المجهري الفلوري الحي. أخيرا ، يتم تحديد خصائص إدراج الكلاميديا من خلال برنامج تحليل المجهر ، وفي النهاية يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري الحي لتصور شوائب الكلاميديا داخل الخلية المضيفة ولقياس المعلمات البيولوجية للشوائب للحصول على نتائج كمية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعداد القائم على الأجسام المضادة في أنه يمكن استخدام استراتيجية التصوير العكسي هذه على الخلايا الحية وأيضا بالتعاون مع ملصقات الفلورسنت الأخرى لتحديد ديناميكيات التضمين لجميع أنواع الكلاميديا.

علاوة على ذلك ، على عكس الطرق الروتينية التي تصنف البكتيريا في الخلايا ، فإن هذا النهج يضيء غشاء التضمين في الخلايا الحية وبالتالي يمكن أن يكشف عن الخصائص الديناميكية المهمة لهذا الحيز المحتوي على العامل الممرض. بعد توليد خلايا هيلا الفلورية ، وفقا للوحة بروتوكول النص ، خلايا GFP Hela على وعاء استزراع مرغوب فيه ، مثل أطباق القاع الزجاجي للتصوير عالي الدقة 4 24 لوحة بئر لتقدير IFU وفحص الآبار المتعددة لإذابة أنبوب مجمد يحتوي على كوتوس ، أو أي سلالة أخرى مرغوبة على الجليد وتخفيفها في HBSS إلى تعدد العدوى المطلوب. لإجراء عدوى ثابتة ب Crich Cotus ، يقوم LGV zero VL two بشفط الوسائط من الآبار واستخدام HBSS لغسل خلايا GFP hela.

أضف البكتيريا المخففة إلى الآبار واحتضن عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وشفط الخلايا واغسلها باستخدام HBSS. ثم بعد إضافة وسط النمو ، قم باحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لإجراء عدوى بمساعدة الطرد المركزي ب crich to serovar D أو أي سلالة متلمة أخرى. استخدم HBSS لغسل خلايا GFP hela وإضافة البكتيريا المخففة إلى الخلايا.

ثم ضع طبق الخلايا المصابة في حامل صفيحة متعدد الآبار لدوار دلو متأرجح في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. الطرد المركزي للخلايا عند 900 مرة جم و 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع أوعية الاستزراع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في خزانة السلامة الحيوية ، وشفط الخلايا وغسلها مرتين باستخدام HBSS وأضف وسط النمو.

احتضان طبق الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية. لتصور شوائب الكلاميديا ، قم بإزالة خلايا هيلا GFP المصابة بالكلاميديا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون واستخدم RPMI بدون فينول أحمر و 5٪ FBS لاستبدال الوسائط ، ضع الطبق أو اللوحة متعددة الآبار على مجهر مضان مقلوب بهدف زيت 20 × أو أعلى. باستخدام برنامج التصوير ، حدد خلايا هيلا GFP المصابة بالكلاميديا والتي تظهر على شكل خلايا خضراء تحتوي على ثقوب سوداء كبيرة.

في مربع حوار إعداد الاكتساب، قم بتكوين البرنامج للحصول على القناة الخضراء وأي قناة أخرى مضافة في العينة. استخدم زر التسجيل المائل للالتقاط للحصول على الصورة في الأوقات المطلوبة. ما بعد العدوى. قم بإزالة خلايا هيلا GFP المصابة بالكلاميديا من الحاضنة وضع الطبق على مجهر مضان عاكس.

ركز على السهول الوسطى للخلايا حيث تكون الشوائب في أقصى قطر ومحصول. تكتسب الحواف الواضحة صورا في 10 حقول على الأقل لكل بئر. تمثل الآبار عادة التكرارات أو المتغيرات التجريبية.

للعثور على خلايا GFP hela ضمن علامة تبويب القياسات، استخدم الأمر find objects وحدد القناة الخضراء. اضبط شدة العتبة بناء على الشدة النسبية للخلايا. احسب يدويا عدد الشوائب أو المقصورات السوداء وخلايا GFP hela بالعين أو استخدم خوارزميات برامج التصوير لتحديد الشوائب وحسابها تلقائيا.

قم بتصفية الكائنات المحددة عن طريق الاحتفاظ فقط بتلك التي يزيد حجمها عن خمسة ميكرومترات مربعة. تشير إلى هذا على أنه السكان الأول. باستخدام هذه المجموعة السكانية، قم بتطبيق الأمر fill holes in objects حيث أن الإدخال الذي تنشئ هذه الخطوة المحتوى الثاني.

اطرح السكان واحدا من السكان اثنين للحصول على شوائب الكلاميديا المميزة بشكل إيجابي والتي تم تحديدها على أنها مجموعة ثلاثة. استخدم الأمر filter population لتطبيق عامل تصفية حجم على المحتوى الثلاثة على سبيل المثال ، الاحتفاظ بأشياء أكبر من 25 ميكرومتر مربع للشوائب في الخلايا ، مصابة لمدة 24 ساعة أو أكثر لأوقات الإصابة المبكرة ، يضبط مرشح الحجم للحفاظ على الأشياء أكبر من أربعة ميكرومتر مربع.

نظرا لأن هذه الشوائب أصغر بكثير ، ينتج عن مرشح الحجم مجموعة من الكائنات المصنفة على أنها شوائب. استخدم برنامج التصوير لحساب البيانات الكمية من الصور مثل رقم التضمين والتضمين والحجم والتضمين. يمكن رؤية محيط الإصابة بشوائب الكلاميديا بسهولة على شكل بقع سوداء والخلايا المضيفة أو البروتين الفلوري الذي يعبر عن الكلاميديا داخل الخلايا المضيفة ، ويمكن استغلال وضوحها لتحديد الأدلة الآلية عبر العديد من مجالات الرؤية و / أو العلاجات.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، يتمثل أحد التطبيقات الرئيسية في تحديد وحدات تشكيل الكلاميديا في الخلايا المصابة الحية ، مما يلغي الحاجة إلى إجراءات التألق المناعي ، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. ميزة رئيسية أخرى لنهج التصوير هذا هي أنه يمكن تطبيقه بسهولة على أي نوع أو سلالة من الكلاميديا. في هذا المثال ، تم إجراء تحليل المسار الزمني لخلايا GFP hela المصابة بواحد من أربعة أنواع أو سلالات الكلاميديا لكل نوع من هذه الأنواع والسلالات.

تم وضع علامة على الشوائب وتحليلها لحساب متوسط مساحتها وطول محيطها وعددها لكل خلية في الأوقات المشار إليها. توفر هذه السمات معلومات مهمة حول بيولوجيا شوائب الكلاميديا ، بما في ذلك كيفية تفاعلها مع الخلية المضيفة. يظهر هنا مقطع فيديو لخلايا الكرز المصابة ب GFPC ، Tracom L اثنان يتألفان من صور بفاصل زمني تم التقاطها على فترات خمس دقائق لمدة 125 دقيقة ، بدءا من 48 ساعة بعد الإصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية التصوير العكسي هذه ليس فقط لتصور شوائب الكلاميديا ، ولكن لتقدير ديناميكيات التضمين مثل محيط منطقة التضمين وعدد الشوائب لكل خلية. هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة مقارنة بتقنيات التصور التقليدية وتعمل مع جميع أنواع وسلالات الكلاميديا.