باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وقياس ديناميكيات نمو المشتملات الكلاميدية في الخلايا الحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد خلايا مضيفة فلورية تعبر بشكل مستقر عن بروتين فلوري مثل GFP في السيتوبلازم الخاص بها. بعد ذلك، يتم إصابة الخلايا المضيفة بالكلاميديا وتُترك لتتحضن.

بعد ذلك، يتم تصوير الخلايا المصابة باستخدام مجهر الفلورسنت الحي. وأخيراً، يتم قياس خصائص اشتمالات الكلاميديا من خلال برنامج تحليل مجهري؛ حيث يُستخدم مجهر الفلورسنت الحي في نهاية المطاف لتصوير اشتمالات الكلاميديا داخل الخلية المضيفة ولقياس المعايير البيولوجية للاشتمالات للحصول على نتائج كمية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التعداد القائم على الأجسام المضادة، في أن استراتيجية التصوير العكسي هذه يمكن استخدامها على الخلايا الحية، وأيضاً بالتعاون مع علامات فلورسنتية أخرى لقياس ديناميكيات الاشتمال لجميع أنواع الكلاميديا.

علاوة على ذلك، وبخلاف الطرق الروتينية التي تضع علامات على البكتيريا داخل الخلايا، فإن هذا النهج يضيء الغشاء الشامل في الخلايا الحية، وبالتالي يمكنه الكشف عن خصائص ديناميكية مهمة لهذه الحجرة التي تحتوي على الممرض. بعد توليد خلايا HeLa فلورية، ووفقاً لبروتوكول النص، يتم وضع خلايا HeLa GFP في وعاء استزراع مناسب، مثل الأطباق ذات القاعدة الزجاجية للتصوير عالي الدقة أو أطباق 24 بئراً لتحديد وحدات تكوين الجسم الشامل (IFU) والفحص متعدد الآبار؛ يتم إذابة أنبوب مجمد يحتوي على سلالة Crich Cotus، أو أي سلالة أخرى مرغوبة من الكلاميديا، على الثلج وتخفيفها في HBSS للوصول إلى تعدد العدوى المطلوب. لإجراء عدوى ثابتة باستخدام Crich Cotus, LGV zero VL two، يتم سحب الوسط من الآبار واستخدام HBSS لغسل خلايا HeLa GFP.

أضف البكتيريا المخففة إلى الآبار واتركها للحضن عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم اشفط الخلايا واغسلها باستخدام HBSS. بعد ذلك، أضف وسط النمو واحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حضانة ثاني أكسيد الكربون لإجراء عدوى بمساعدة الطرد المركزي باستخدام سلالة crich من النمط المصلي D أو أي سلالة أخرى من الكلاميديا. استخدم HBSS لغسل خلايا HeLa التي تعبر عن GFP ثم أضف البكتيريا المخففة إلى الخلايا.

بعد ذلك، ضع طبق الخلايا المصابة في حامل أطباق متعدد الفجوات لمحور دوران ذي دلاء متأرجحة في جهاز طرد مركزي مكتبي. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 900 ×g و25 °C لمدة ساعة واحدة. ثم ضع أوعية الزرع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 °C لمدة ساعة واحدة داخل كابينة السلامة البيولوجية، ثم اسحب الخلايا واغسلها مرتين باستخدام HBSS وأضف وسط النمو.

قم بتحضين طبق الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية. ولتوضيح مشتملات الكلاميديا، أخرج خلايا HeLa GFP المصابة بالكلاميديا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون واستخدم وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر و5% FBS. لاستبدال الوسط، ضع الطبق أو الطبق متعدد الفجوات على مجهر فلوريسنت مقلوب باستخدام عدسة زيتية بقوة 20x أو أعلى. وباستخدام برنامج التصوير، حدد خلايا HeLa GFP المصابة بالكلاميديا والتي تظهر كخلايا خضراء تحتوي على ثقوب سوداء كبيرة.

في مربع حوار إعدادات الاستحواذ، قم بتكوين البرنامج لاستحواذ القناة الخضراء وأي قناة أخرى مضافة في العينة. استخدم زر الالتقاط/التسجيل لاستحواذ الصورة في الأوقات المطلوبة. بعد العدوى، قم بإزالة خلايا HeLa التي تعبر عن GFP والمصابة بالكلاميديا من الحاضنة وضع الطبق على مجهر فلوري مقلوب.

ركز على المستويات المتوسطة من الخلايا حيث يكون قطر الاشتمالات وإنتاجيتها في حدها الأقصى. التقط صورًا بحواف واضحة في 10 حقول على الأقل لكل بئر. تمثل الآبار عادةً مكررات أو متغيرات تجريبية.

لإيجاد خلايا hela التي تعبر عن GFP تحت علامة تبويب القياسات، استخدم أمر "البحث عن الكائنات" (find objects) وحدد القناة الخضراء. اضبط شدة العتبة بناءً على الشدات النسبية للخلايا. قم بعدّ عدد الاشتمالات أو الحجرات السوداء وخلايا hela GFP يدويًا بالعين المجردة، أو استخدم خوارزميات برمجيات التصوير لتحديد الأشتمالات وعدّها تلقائيًا.

قم بتصفية الكائنات المختارة من خلال الإبقاء فقط على تلك التي تزيد مساحتها عن 5 square micrometers. أطلق على هذه المجموعة اسم المجموعة الأولى. وباستخدام هذه المجموعة، قم بتطبيق أمر "fill holes in objects"، حيث ستؤدي هذه الخطوة إلى إنشاء المجموعة الثانية.

اطرح المجموعة السكانية الأولى من المجموعة السكانية الثانية للحصول على اشتمالات الكلاميديا المحددة إيجابياً والتي تم تعيينها كمجموعة سكانية ثالثة. استخدم أمر تصفية المجموعة (filter population) لتطبيق مرشح الحجم على المجموعة السكانية الثالثة. على سبيل المثال، احتفظ بالأجسام التي تزيد مساحتها عن 25 square micrometers للاشتمالات في الخلايا المصابة لمدة 24 ساعة أو أكثر، وبالنسبة لأوقات العدوى المبكرة، اضبط مرشح الحجم للاحتفاظ بالأجسام التي تزيد مساحتها عن 4 square micrometers.

نظرًا لأن هذه المشتملات أصغر حجمًا بكثير، فإن مرشح الحجم يؤدي إلى الحصول على مجموعة من الأجسام التي تُصنف كمشتملات. استخدم برنامج التصوير لحساب البيانات الكمية من الصور، مثل عدد المشتملات، وحجم المشتملات، ومحيط المشتملات. عند الإصابة بـ chlamydia، تكون المشتملات مرئية بسهولة كبقع سوداء والخلايا المضيفة أو chlamydia التي تعبر عن البروتين الفلوري داخل الخلايا المضيفة، ويمكن استغلال وضوحها للتحديد الآلي عبر العديد من مجالات الرؤية أو المعالجات.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني، يتمثل أحد التطبيقات الرئيسية في تحديد وحدات تشكيل المشتملات الخاصة بالكلاميديا في الخلايا الحية المصابة، مما يلغي الحاجة إلى إجراءات التألق المناعي التي تستغرق وقتاً طويلاً وتكون مكلفة. وهناك ميزة أساسية أخرى لهذا النهج في التصوير وهي إمكانية تطبيقه بسهولة على أي نوع أو سلالة من الكلاميديا. في هذا المثال، تم إجراء تحليل للمسار الزمني لخلايا hela المعبرة عن GFP والمصابة بواحد من أربعة أنواع أو سلالات كلاميدية لكل من هذه الأنواع والسلالات.

تم تحديد الاجتثاثات وتحليلها لحساب متوسط مساحتها ومحيطها وعددها لكل خلية في الأوقات المحددة. وتوفر هذه الخصائص معلومات مهمة حول بيولوجيا الاجتثاثات الكلاميدية، بما في ذلك كيفية تفاعلها مع الخلية المضيفة. يظهر هنا مقطع فيديو لخلايا hela معبرة عن m cherry ومصابة بـ GFPC, Tracom L two، يتكون من صور بفاصل زمني تم التقاطها كل خمس دقائق لمدة 125 دقيقة، بدءاً من 48 ساعة بعد العدوى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام تقنية التصوير العكسي هذه ليس فقط لتصوير المشتملات الكلاميدية، ولكن أيضاً لقياس ديناميكيات المشتملات مثل محيط مساحة المشتمل، وعدد المشتملات لكل خلية. وتعتبر هذه التقنية فعالة من حيث التكلفة مقارنة بتقنيات التصوير التقليدية، كما أنها تعمل مع جميع أنواع وسلالات الكلاميديا.