تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة التكافل البكتيري المسمى بالفلورسنت داخل مضيف الديدان الخيطية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تسمية البكتيريا أولا ببروتين الفلورسنت من خلال الاقتران. الخطوة الثانية هي عزل الديدان الخيطية AIC عن طريق حصاد البيض.

بعد ذلك ، تزرع الديدان الخيطية AIC مع مكافئتها البكتيرية المصنفة فلورية للسماح بالارتباط الطبيعي في النهاية بتوطين المتماثل البكتيري داخل مضيف الديدان الخيطية. ويمكن تحديد تواتر هذا الارتباط داخل مجموعة الديدان الخيطية عن طريق المجهر الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التعايش ، مثل مكان توطين البكتيريا داخل مضيفها ، وما هو توزيع النقل البكتيري عبر مجموعة مضيفة؟

بعد نمو السلالات البكتيرية بين عشية وضحاها ، والزراعة الفرعية ، يتدفق المتلقي والمتبرع والمساعد إلى وسط نمو غني بالمغذيات يفتقر إلى المضادات الحيوية بنسبة واحد إلى 100 من الثقافة إلى الوسط ، ثم ينمو الثقافات في درجة الحرارة المناسبة لكل سلالة حتى تصل إلى منتصف مرحلة النمو اللوغاريتمية. بعد ذلك ، اجمع السلالات في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد وقم بالطرد المركزي للثقافات المختلطة لمدة دقيقتين عند 17 ، 900 Gs ، صب المادة الطافية وقم بتدوير الحبيبات في 30 ميكرولتر من الوسائط الطازجة. ثم ضع التعليق على لوحة وسائط غنية بالمغذيات بدون أي مضادات حيوية ، واترك البقعة تجف عندما يجف التعليق.

احتضان اللوحة المقلوبة طوال الليل عند درجة حرارة مثالية للبكتيريا المتلقية ومسموح بها للمتبرع والمساعد إن أمكن. الآن ، اكشط البقعة والخط لمستعمرات مفردة على صفيحة مضاد حيوي انتقائية للحصول على ثقافة نقية من خط البكتيريا ، مستعمرة واحدة للعزل. أخيرا ، تأكد من أن المستعمرات الناتجة هي المتلقي المتكافئ وليست سلالة المتبرع.

عن طريق فحص وجود أنماط ظاهرية محددة للمتلقي. على سبيل المثال ، يمكن تمييز بكتيريا cino abdi عن الإشريكية القولونية عن طريق إجراء اختبار محفز تم فحصه بحثا عن وجود البلازميد عن طريق تأكيد التألق تحت الطول الموجي المقابل لبروتين البلازميد الفلوري. بعد زراعة البكتيريا الطبيعية المتماثلة بين عشية وضحاها ، انشر 600 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية على ثمانية إلى 10 ، 10 ملليمترات من تهوية الدهون ، ثم احتضان الصفائح في الظلام دون رطوبة عند 25 درجة مئوية.

بعد يومين ، أضف 5،000 من الديدان الخيطية اليافعة المعدية في 500 ميكرولتر من الوسائط إلى المروج البكتيرية. بعد احتضان الصفائح عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام أخرى ، ضع 20 ميكرولترا من الماء على شريحة مجهرية. ثم استخدم عصا معقمة لكشط كمية صغيرة من الديدان الخيطية من حديقة البكتيريا.

ضع العصا في الماء للسماح للديدان الخيطية بالسباحة. انظر إلى هذه الشريحة تحت تكبير منخفض. إذا كان البيض والإناث مرئيا ، فاستمر عندما تحتوي الإناث على البيض ، ضع بضعة ملليلتر من الماء على سطح الصفائح ، وقم بتدوير الألواح برفق ثم صب الماء في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

يجب أن تخرج الديدان الخيطية من الألواح ولم تعد مرئية على سطح اللوحة. اسمح للديدان الخيطية بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم قم بوضع الأنابيب في الماء الزائد من أعلى الأنبوب وأعد ملء الأنبوب بالماء النظيف. بعد السماح للديدان الخيطية البالغة بالاستقرار وسحب الماء الزائد مرة أخرى ، املأ الأنابيب المخروطية بمحلول البيض.

ثم امزج الأنابيب عن طريق الانعكاس اللطيف لمدة 10 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة. بعد الاهتزاز على الفور ، قم بالطرد المركزي للأنابيب المخروطية لمدة 10 دقائق بالضبط عند 1 ، 250 جيجابايت ودرجة حرارة الغرفة مع الانقطاع. ثم قم بصب المادة الطافية بسرعة ، وأعد تعليق الحبيبات بمحلول البيض عن طريق سحب العينات واملأ الأنبوب المخروطي بمحلول البيض الطازج.

امزج معلق البيض جيدا عن طريق قلب الأنبوب ثلاث إلى خمس مرات ثم بعد تكوير البيض على الفور وصب المادة الطافية كما هو موضح للتو. أعد تعليق الحبيبات في كراهية النساء أو المرق أو LB عن طريق سحب العينات ، ثم انقل معلق البيض إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الآن املأ الأنبوب سعة 15 مليلتر بالرطل ، واغسل البيض ثلاث مرات في المرق باستخدام نفس تقنية الخطوة السريعة كما هو موضح للتو ، ثم قم بتخفيف بيض الديدان الخيطية P المعلق إلى 10 بيضات على الأقل لكل ميكرولتر.

انقل البيض إلى طبق بتري يبلغ طوله ستة سنتيمترات يحتوي على خمسة ملليلتر من LB والمضادات الحيوية ضد البكتيريا المستعمرة. يمكن تخزين اللوحة ملفوفة في perfil لمدة تصل إلى أربعة أيام بعد النمو بين عشية وضحاها واختيار البكتيريا الفلورية. استخدم عصا معقمة لنشر 600 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية على 10 ملليمترات من هوايات الدهون ، ولاحتضان المزرعة عند 25 درجة مئوية.

بعد يومين ، قم بتوزيع 500 إلى 5،000 بيضة نيماتودا على كل طبق دهني. إذا تم تخزين الطبق ، اغسل البيض في 15 مل من LB كما هو موضح مرة واحدة على الأقل قبل تلقيح البيض في المروج البكتيرية المعدة مسبقا. ثم احتضان البكتيريا الخيطية في الظلام بدون رطوبة عند 25 درجة مئوية حتى تظهر الأحداث المعدية كحلقة بيضاء غامضة على حافة اللوحة.

عندما يتم ملاحظة الأحداث المعدية. قم بإزالة غطاء صفيحة أجار الدهون وضع الجزء السفلي من اللوحة في قاع طبق بتري فارغ 100 ملم × 20 ملم. ثم املأ طبق بتري بما يكفي من الماء ليصل إلى حوالي نصف ارتفاع الصفيحة الأصغر واحتضان مصيدة الماء حتى تظهر الأحداث المعدية في الماء.

بعد جمع الديدان الخيطية من الماء أو في مرحلة الحياة المرغوبة من العشب البكتيري المناسب ، قم بإذابة بضع حبات من أولي في 30 ميكرولتر من الماء ، وعند واحد إلى ميكرولتر من هذا العامل المشل لكل 50 ميكرولتر من عينة الديدان الخيطية. ثم انقل حوالي 20 إلى 30 ميكرولترا من عينة الديدان الخيطية المشلولة إلى شريحة مجهرية وضع زلة غطاء أعلى العينة. اعرض الديدان الخيطية باستخدام الفحص المجهري الضوئي للتأكد من وجود الديدان الخيطية في مجال الرؤية.

لتحديد توطين البكتيريا. تصوير الديدان الخيطية تحت المجهر الفلوري بالإضافة إلى إعداد الفحص المجهري الضوئي ، ثم تركيب الصور. قد يكون من الضروري تجربة العديد من التكبيرات والمناظر للديدان الخيطية للعثور على البكتيريا.

تم إحصاء مجموعة من الديدان الخيطية من اثنين من الوسائط وتسجيلها للاستعمار من قبل المتكافئ البكتيري. للحصول على إحصاءات قوية ، من الأفضل حساب ما لا يقل عن 100 ديدان خيطية لكل عينة مع 30 على الأقل تقع في كل فئة كما هو موضح في الجدول. يتم استعمار هذه الديدان الخيطية عند مستوى 14.6٪ تقريبا عند زراعتها على أجار الدهون و 68.6٪ عند زراعتها على الكبد والكلى.

الديدان الخيطية والأنواع البكتيرية الأخرى لها مستويات مختلفة من الاستعمار. يوضح هذا التخطيطي المظهر العام لإناث شتاينر نيما. يظهر الجزء الداخلي صورة تباين التداخل التفاضلي لأنثى رسم S fot عند تكبير 20 ×.

يشير السهم الأسود في الجزء الداخلي إلى الفرج ، بينما تشير الأسهم البيضاء إلى البيض المرئي. تظهر هذه الصورة بيضة نيماتودا فولت متطورة ولكنها غير مفرغة بتكبير 40 × ، وتم تصوير هذه البيض المعزولة من الديدان الخيطية فولتا تحت تكبير 10 ×. هنا ، تظهر صور مجهرية تمثيلية لنيماتودا شتاينر نيما المرتبطة ببكتيريا Xeno aptus في هذه الصورة الأولى.

ارتبطت الديدان الخيطية لألفين بمعرضها المتكافل البكتيري الذي يعبر عن GFP لإنشاء هذه الصورة المركبة. تم تراكب صورة تباين الطور مع صورة الفلورسنت. يشير السهم إلى البكتيريا الموجودة داخل الديدان الخيطية اليافعة المعدية.

تظهر هذه الصورة الديدان الخيطية اليافعة S carpa capsi مع GFP التي تعبر عن X nla. تم إنشاء الصورة بطريقة مماثلة للصورة السابقة وتصور الديدان الخيطية اليافعة مع بروتين الفلورسنت الأخضر المسمى بكتيريا تم تصورها على أنها قضبان خضراء موضعية في جميع أنحاء تجويف الأمعاء الخيطية. بالإضافة إلى الإجراء الموصوف ، يمكن دمج طرق أخرى مثل التلاعب الجيني للمتماثل البكتيري قبل الارتباط بمضيف الديدان الخيطية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي الآليات الجزيئية اللازمة لارتباط الميكروب المضيف.