الخلايا الجذعية العلاجية البرمجة لتكوين الأوعية الدموية عن طريق تحلل البوليمر النانوية

نحن تصف طريقة برمجة الخلايا الجذعية لoverexpress العوامل العلاجية لتكوين الأوعية الدموية باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية القابلة للتحلل. وتشمل العمليات المذكورة التوليف البوليمر، بنقل العدوى إلى خلايا الجذعية المشتقة الدهنية في المختبر، والتحقق من صحة فعالية الخلايا الجذعية المبرمجة لتعزيز الأوعية الدموية في الفئران hindlimb نموذج نقص التروية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات استخدام الجسيمات النانوية البوليمرية للإفراط في التعبير عن الجينات العلاجية في الخلايا الجذعية باستخدام نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية البحرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي أولا من خلال تفاعل إصدار ميكروفون من خطوتين ، متبوعا بتصنيع الجسيمات النانوية البوليمرية التي تشفر الجينات العلاجية. الخطوة الثانية هي نقل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية في المختبر إلى عامل النمو البطاني الوعائي المفرط في التعبير.

بعد ذلك ، يتم حقن الخلايا الجذعية المبرمجة في العضل في الطرف الخلفي الإقفاري لإنتاج NC لعوامل علاجية. الخطوة الأخيرة هي مراقبة بقاء الخلية وإعادة نضح الدم في الطرف الإقفاري بمرور الوقت باستخدام التصوير الحيوي وتصوير دوبلر بالليزر. في النهاية ، يمكن إجراء التعبير الجيني الكمي والأنسجة لإظهار التعبير الموضعي للعوامل العلاجية وفعالية تجديد الأنسجة.

ميزة هذه التقنية على الطرق التقليدية لتكوين الأوعية الدموية هي استخدام الخلايا الجذعية كوسائل لتوصيل الأدوية. تسمح لنا هذه الاستراتيجية بتوظيف القدرة الطبيعية للخلايا الجذعية على الهجرة نحو نقص التروية ، كما تسمح بالاستجابة الديناميكية للإشارات البيئية الدقيقة. تتميز الجسيمات النانوية المستخدمة في توصيل الحمض النووي بالبلازما بكفاءة عالية وقابلة للتحلل البيولوجي مما يوفر سمية خلوية أقل وعددا أكبر من نسخ الحمض النووي التي يتم تسليمها داخل الخلايا.

يمكن تطبيق هذه التقنية على العديد من العلاجات القائمة على الخلايا ذات الصلة سريريا لأنها تستخدم ناقلا غير فيروسي قابل للتحلل لإدخال الجينات في الخلايا الذاتية العمل في غطاء الدخان ، ووزن قرص البوتان DLI ، ونقل المادة إلى قارورة استنشاق زجاجية تحتوي على قضيب تحريك. بعد ذلك ، أضف خمسة بنتول أمينو مسخن مسبقا إلى نفس القارورة. ضع القارورة على الفور على طبق تقليب واضبط السرعة على 600 دورة في الدقيقة.

انقل القارورة إلى فرن على حرارة 90 درجة مئوية وزد سرعة التقليب إلى 1000 دورة في الدقيقة بعد أربع ساعات ، اخفض السرعة إلى 300 دورة في الدقيقة وحركها لمدة 12 إلى 16 ساعة إضافية. عندما تصبح جاهزا ، أضف 10 ملليلتر من رباعي اليوران المائي إلى خمسة جرامات من C 32 في قارورة زجاجية تحتوي على شريط تحريك. بعد الالتفاف في دوامة رقائق معدنية على ارتفاع حتى تذوب تماما في قارورة زجاجية منفصلة تحتوي على شريط تحريك ، أضف 10 ملليمولار من رباعي إيثيلين جلايكول ديامين.

أضف 40 مل من THF إلى هذه القارورة ، ضع كلا القواريرتين على طبق تقليب لمدة خمس دقائق قبل دمجهما معا. قم بتغطية النتيجة بورق القصدير واتركها تحدق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. المنتج النهائي يسمى C 32 1 22.

بعد ذلك ، انقل 30 مل من الأثير الداثيل اللامائي إلى كل من خمسة أنابيب صقر سعة 50 مل. بعد إضافة C 32 1 22 إلى الأثير اللامائي ، يشكل محلول أبيض غائم دوامة الأنبوب ثم يقوم بالطرد المركزي. سوف يتجمع البوليمر المستخرج في قاعدة الأنبوب ، ويتخلص من المحلول العلوي ويكرر هذه الخطوات مرتين أخريين.

بمجرد استخراجها ، ضع الأنابيب المفتوحة في المجفف ونظفها بالمكنسة الكهربائية طوال الليل ، وتأكد من حماية الأنابيب من الضوء. في اليوم التالي ، قم بوزن الأنابيب التي تحتوي على C 32 1 22 لتحديد الكتلة النهائية. أخيرا قم بإذابة البوليمر المستخرج في DMSO اللامائي بتركيز 100 ملليغرام لكل مليلتر.

لتحضير الجسيمات النانوية. أولا ، قم بتخفيف الحمض النووي للبلازما إلى تركيز نهائي قدره 120 ميكروغرام لكل ملليلتر في أسيتات الصوديوم في أنبوب ثان ، وتخفيف C 32 ، 1 ، 22 إلى تركيز نهائي قدره 3.6 ملليغرام لكل مليلتر. في أسيتات الصوديوم ، امزج محتويات كل أنبوب في أنبوب فالكون واحد سعة 15 مليلتر ودوامة على الفور على ارتفاع لمدة 10 ثوان.

دع الأنبوب يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق حتى يحدث تكوين الجسيمات النانوية أثناء تكوين الجسيمات النانوية. استبدل الوسط في قارورة زراعة الأنسجة الموجودة مسبقا ب 7.8 ملليلتر. مكمل كامل DMEM.

انقل محلول الجسيمات النانوية إلى قارورة زراعة الأنسجة ووزعها بالتساوي قبل وضعها في الحاضنة. بعد ساعتين ، استبدل الجسيمات النانوية التي تحتوي على وسائط ب DMEM. بعد أربع ساعات ، تصبح الخلايا جاهزة للحقن في الجسم الحي.

عندما تكون الخلايا المنقولة جاهزة ، قم بحساب الخلايا بكثافة 10 في 10 من الخلايا الست لكل مليلتر في PBS للتأكد من أن كل فأر يتلقى كمية متساوية. افصل معلقات الخلية إلى أنابيب einor بحجم 110 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتخدير الفأر الذي خضع سابقا لإقفار الطرف الخلفي.

بعد تأكيد التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، نظف موقع الحقن بحقنة قياس 27. أعد تعليق الخلايا واسحب 100 ميكرولتر من التعليق. حقن نصف تعليق الخلية في منطقة العضلة المقربة ، ثم حقن النصف الآخر في منطقة عضلة الساق.

بعد الحقن ، اترك المحقنة في مكانها لمدة 15 إلى 30 ثانية على الأقل لمنع التسرب. عند اكتمال الحقن ، حافظ على دفء حتى يتعافى تماما. للتصوير الحيوي ، تأكد من التخدير بقرصة إصبع القدم ثم نظف موقع الحقن كما هو موضح سابقا.

املأ حقنة الأنسولين ب 100 ميكرولتر من لوسيفر وحقنها داخل الصفاق. قبل وضع في غرفة تصوير ivus Luciferase ، قم بتصوير الفئران بوقت تعرض مدته دقيقة واحدة. عند الحصول على الصورة، حدد منطقة الاهتمام.

في هذه الحالة ، يستمر الطرف الإقفاري في موقع حقن الخلية في قياس إشارة لوسيفيراز كل ثلاث إلى خمس دقائق حتى تصل الإشارة إلى ذروتها وتبدأ في الانخفاض. هذه هي القيمة المستخدمة للمقارنة عبر الفئران وبمرور النقاط الزمنية عند اكتمالها ، قم بإزالة الفئران من الغرفة والحفاظ على دفء حتى يتعافى تماما. يتم حصاد الأنسجة في وقت محدد.

نقاط بعد التعادي بعد القتل الرحيم ، قم بقطع الجلد المحيط بالطرف الخلفي محيطيا في منطقة البطن البعيدة والقريبة من الطرف الخلفي. بعد سحب الجلد للخلف ، قم ببتر الطرف بين مفصل الحوض وعظم الفخذ. أخيرا ، يتم عزل المقرب الإنسي وعضلات المعدة.

لمزيد من التحليل ، تصور هذه الصور توليف C 32 1 22. هنا ، تم تشكيل C 32 AC المنتهي المرتبط ب ACR عن طريق تفاعل إصدار ميكروفون بين مونومر مع مجموعات نهاية DAL ومونومر مع مجموعة نهاية متوسطة أولية. في هذا المثال ، يمكن تشكيل بوليمرات PBAE المعدلة عن طريق إضافة مونومرات منتهية متوسطة لتحسين كفاءة التعدين.

يتضح التعدي الناجح من خلال الإفراط في التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر كما هو موضح هنا. تظهر بيانات التصوير الحيوي هذه الفأر في اليوم صفر واليوم 14. بعد حقن الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون الإيجابية GFP لوسيفيراز في الطرف الخلفي ، تظهر صور دوبلر التمثيلية تحريض نقص التروية في جانب واحد من الطرف الخلفي العاكس في اليوم صفر وإعادة نضح الدم بنجاح.

14 يوما من حقن VEGF على شفط الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. أكد R-T-P-C-R النجاح في تنظيم VGF ، وهو البروتين العلاجي المشفر في المجموعة المعالجة بعد أربعة أيام من حقن الخلية ، بينما لم يتم الكشف عن أي تعبير في التحكم في PBS. يمكن تنفيذ طرق أخرى تطبق نهج توصيل الخلايا الجذعية والجينات من أجل تحديد أهداف علاجية جديدة لتعزيز تجديد الأنسجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي للعلاج الجيني غير الفيروسي واستخدام هذه البوليمرات لبرمجة الخلايا الجذعية لعلاج نقص التروية والجسم الحي قد يكون استخدام الخلايا الجذعية المهندسة غير الفيروسية للإفراط في التعبير عن العوامل العلاجية في الموقع مفيدا على نطاق واسع لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية.