تحديد هيكل وتنسيق مجمعات الببتيد المعدنية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي 1D و 2D ¹H

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية الببتيد المقلد لبروتين Metallo chaperone المركب بالنحاس. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير العينة أولا في بيئة خالية من الأكسجين. الخطوة الثانية هي الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي التي تظهر التفاعلات بين ذرات الهيدروجين.

بعد ذلك ، يتم تعيين التفاعلات المكانية على قالب ببتيد خطي. الخطوة الأخيرة هي العثور على هيكل تمثيلي منخفض الطاقة يناسب البيانات. في النهاية ، يتم استخدام الهياكل المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي لتحديد طريقة الربط وإجراء التحليل الهيكلي على المركب المرتبط بالنحاس.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، هي أنه يمكنك استخدامها للنظر في مجمعات الربط الأسبوعية وأيضا في الجزيئات والمجمعات التي لا تتبلور. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبروتينات ربط النحاس. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الفصول المعدنية الأخرى لدراسة كيف تمكن البروتينات من التوصيل الآمن لأيونات المعادن الأساسية ، والتي يحتمل أن تكون سامة في بيئة خط الخلية.

للبدء ، قم بإعداد عينات في بيئة خالية من الأكسجين لمنع النحاس من الأكسدة لتحضير عينة APO ، قم بإذابة ما يقرب من ملليغرام إلى ملليغرامين من الببتيد في 450 إلى 500 ميكرولتر من مذيب درجة الرنين المغناطيسي النووي Deuterated لعينة النحاس المتفاعلة ، قم بإذابة نفس الكمية مثل ببتيد APO مع كمية مولار EQU من الملح المعدني في 450 إلى 500. ميكرولتر من مذيب الرنين المغناطيسي النووي يقوم بتصفية كل محلول باستخدام زجاج مركزي أو ورق ترشيح أو أي تقنية أخرى تناسب المركبات قيد الفحص ولا تمتصها. هذا ضروري لإزالة أي جزيئات معدنية ، والتي ستؤثر على التجانس.

انقل المحاليل إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي وأغلق العينات في الأنابيب. قبل مغادرة صندوق القفازات ، أخرج العينات من صندوق القفازات وأغلقها. سجل أطياف البروتون أحادية البعد لعينات APO والنحاس المتفاعلة في آلة الرنين المغناطيسي النووي ومقارنة.

يتميز ببتيد APO بالمرونة ويظهر متوسط التأكيدات ، ولكن عند التفاعل مع النحاس ، يكون لأميدات الببتيد المرتبطة بنية أكثر صلابة. لذلك ، يجب أن يظهر طيف الببتيد المحتوي على النحاس تغييرا كبيرا في التحول الكيميائي في منطقة الأميد ، وقد يتم حل القمم. قم بإعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي المحسنة أو المريحة أو الفضولية أو الوردية في ظل ظروف متطابقة كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بتشغيلها بالتسلسل.

قم بإجراء تجارب أحادية البعد بين كل تجربة للتأكد من أن تكوين العينة يظل ثابتا طوال فترة الحصول على البيانات. بعد معالجة البيانات كما تمت مناقشتها في بروتوكول النص ، قم بإعداد مجموعة من الأطياف المريحة والمتراكبة على الطيف الوردي والوردي. لتعيين جميع قمم NOE في الطيف.

ابدأ بتعيين القمم التي تتداخل مع إشارات السموم في منطقة بصمة الإصبع. نظرا لأن هذا سيسهل إدخالات تخصيص الذروة اللاحقة مع سجل برنامج Sparky ، فإن القمم المعينة تترجم H alpha إلى قيم اقتران بروتين أميد إلى زوايا dedal. قم أيضا بترجمة القمم إلى قيود المسافة من خلال دمج القمم من داخل البرنامج وترجمتها باستخدام تفاعل المسافة المعروفة.

إذا تداخلت القمم أو تعذر استخدام طرق التكامل التلقائي ، فيمكن تصنيف القمم على أنها قوية أو متوسطة أو ضعيفة أو ضعيفة جدا عن طريق التقدير البصري ، ويمكن ترجمة هذه التسميات إلى مسافات تصل إلى 2.5 و 3.5 و 4.5 و 5.5 أنجستروم على التوالي. في استيراد قيود المسافة وزوايا dedal بالتنسيق الصحيح للاستكشاف. سيقوم Explore بالبحث في مساحة تأكيدية للعثور على الهياكل التي تلتزم بالهندسة الكيميائية القانونية.

بالإضافة إلى قيود المسافة التي تم العثور عليها تجريبيا لإنشاء مجموعة لا يتم فيها انتهاك أي من هذه المعلمات. سيشكل هذا فرقة البداية. قم بإجراء أول تشغيل لتحديد الهيكل دون استخدام أي قيود على المعدن للعثور على المخلفات التي تشارك في ربط المعادن دون أي تحيز.

أدخل القيود تدريجيا لتسهيل تحديد الأخطاء في التعيين بالإضافة إلى طاقة NOE ومعلمات الركوع المحاكاة كما هو موضح في بروتوكول النص قبل تقليل الهياكل باستخدام تقليل طاقة التدرج المترافق ل 4 ، 000 تكرار ، وإنشاء مجموعة نهائية من 50 عضوا عادة يقومون بإدخال القيود بطريقة تكرارية على تقرير المجموعة بأكمله لعدد كل نوع من تفاعلات NOE الموجودة. أخيرا ، قم بإنشاء مجموعة من الهياكل التي تلتزم بالهندسة الكيميائية الكنسية وتقرير القيود المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي التجريبي. العدد الإجمالي للتأكيدات ، وعدد تلك التي بها انتهاكات لقيود NM Rived و RMSD للمجموعة بأكملها ، بما في ذلك كل من العمود الفقري وجميع قيم RMSD للذرة الثقيلة.

قم بتحليل مجموعة الطاقة المنخفضة وتحديد السلاسل الجانبية المتبقية التي تكون على مقربة صحيحة من بعضها البعض لتتمكن من ربط أيون المعدن. بمجرد تحديدها ، كرر التحليل ، بما في ذلك بيانات ربط النحاس. بالإضافة إلى قيود المسافة المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي ، أضف الآن قيود ربط المعادن إلى المخلفات المحددة.

أضف معلمات مناسبة لوصف أيون المعدن وطوبولوجيته. أدخل المعلومات الفيزيائية المناسبة مثل أطوال الرابطة الكتلية مع الذرات والزوايا الأخرى ومعلمات التنافر غير الترابط في ملف المعلمة. أضف معلومات الربط إلى ملف المخطط.

تتضمن هذه المعلومات الروابط التي يتم تشكيلها وكسرها ، والرسوم الرسمية التي يتم تغييرها نتيجة للربط. أخيرا ، احصل على مجموعة من الهياكل كما كان قبل ، تمثل المجموعة التي تم حلها المساحة التأكيدية التي يتبناها الببتيد. أثناء قياس الرنين المغناطيسي النووي ، قم باستيراد جميع تأكيدات الهيكل إلى برنامج مال مول لإنشاء مجموعة أولية.

افحص المجموعة لتحديد الاستقرار المحلي للجزيء. حدد قيم RMSD للعمود الفقري والسلسلة الجانبية عن طريق تحديد مناطق المخلفات الأربع اللاحقة على طول التسلسل وجعل البرنامج يحسب RMSD إلى أدنى بنية طاقة أو متوسط ، وتحديد مناطق الجزيء التي تظهر استقرارا محليا عن طريق رسم RMSD المحلي كدالة للتسلسل ، وتراكب المجموعة على طول هذه المنطقة من الجزيء واستخدام هذه المجموعة لمزيد من التحليل. اختر تأكيدات الطاقة المنخفضة التي تلتزم بالقيود المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي.

ستشكل هذه السجل الجماعي منخفض الطاقة وتبلغ عن عدد التأكيدات في المجموعة ومعايير اختيارها وقيم RMSD. إذا لم يتم تحديد وضع ربط المعدن بعد ، فقم بتحليل المجموعة منخفضة الطاقة وتحديد السلاسل الجانبية المتبقية غير الصحيحة. القرب من بعضهما البعض لتكون قادرة على ربط أيون المعدن.

استخدم KYMERA لتحديد المسافات داخل الجزيئات بين الذرات المشتبه في ارتباطها بالمعادن. احسب متوسط المسافات في المجموعة بمجرد تحديدها. كرر التحليل بما في ذلك بيانات ربط النحاس.

افحص المجموعة وحدد البنية الثانوية المحلية داخل الجزيء باستخدام معلمات البحث الافتراضية لبرنامج مول MAL. بعد ذلك ، قم باستيراد المجموعة إلى kymera. يتم الاحتفاظ بالهياكل الثانوية عن طريق الرابطة الهيدروجينية وتشير إلى مناطق مستقرة من الجزيء.

تحديد ارتباط الهيدروجين باستخدام أداة kymera. استمر في التحليل الهيكلي كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم لخص جميع النتائج الهيكلية للكشف عن كيفية تقوية بعضها البعض لدراسة نماذج البروتين المرتبط بالنحاس ، تم تحديد بنية تسلسل الربط المحفوظ للبروتين داخل الببتيد الخطي المشتق بواسطة حالة المحلول NMR ، منطقة أميد الببتيد من 6.7 إلى 8.5.

أظهر PP M تمددا عند التفاعل مع النحاس إلى 6.6 إلى 9.0 PP M.Line.يتضح توسع الخط بسبب أكسدة النحاس الطفيفة في خط الأساس. يظهر هنا تراكب لمناطق بصمات الأصابع في Roy Toxi وأطياف مريحة للببتيد المرتبط بالنحاس. كانت العينة مستقرة بمرور الوقت وتم حل الأطياف بشكل جيد وأعطت 81 تفاعلا من NOE تم الحصول عليها من خلال تجربة وردية.

نظرا لأن الجزيء أعطى تفاعلات NOE قريبة من الصفر في تجربة NO C ، فإن مجموعة الببتيد المشتقة من العينة المتفاعلة ، ولكن باستخدام عدم وجود قيود على المعدن أعطت 47 من أصل 50 بنية غير هيكلية بقيمة RMSD تبلغ 1.44 و 2.07 أنجستروم على العمود الفقري والذرات الثقيلة على التوالي. من بين هؤلاء ، تم اختيار 13 مطابقا منخفض الطاقة لمزيد من التحليل بقيم RMSD تبلغ 0.25 و 0.61 أنجستروم على العمود الفقري والذرات الثقيلة على التوالي. أظهرت مخططات RMSD المحلية منطقة استقرار بين المخلفات الثالثة والسابعة بالإضافة إلى المنطقة الطرفية الصلبة C ، بما في ذلك بقايا البرولين ، تم العثور على هذه المنطقة في تأكيد الانحناء بين المخلفات أربعة وسبعة في جميع التأكيدات.

يتم تثبيت تأكيد الانحناء عن طريق الترابط الهيدروجيني بين المتبرعين بالعمود الفقري والمستقبلين جلايسين خمسة وثلاثة أنين اثنين ، بالإضافة إلى السيستين ستة والسيستين ثلاثة. يتضح هذا الانحناء أيضا في السيستين الثالث والجيب السابع من خلال قيم الاقتران المخفضة في هذه المنطقة. تم تركيب التأكيدات على هذه المنطقة وتحليلها بحثا عن بقايا الربط المحتملة عند النظر في السيستين ثلاثة والسيستين ستة والميثيونين واحد كمخلفات ربط محتملة.

أقصر مسافة من الكبريت إلى ذرة الكبريت هي أنه بين مجموعات حمض الفوليك من السيستين الثالث والسيستين ستة ، تم إدخال ربط النحاس وتكرار الحساب لإعطاء المجموعة المستخدمة للتحليل. تظهر مجموعة الطاقة المنخفضة للببتيد المرتبط بالنحاس أن الأمين الطرفي النهائي قريب من النحاس المرتبط. يظهر هنا سطح توزيع الجهد الكهروستاتيكي مع الجهد الموجب الموضح باللون الأزرق والجهد السالب الموضح باللون الأحمر.

تمتد بقايا الأرجينين من العمود الفقري للببتيد لتشكيل فص موجب من الجهد الكهروستاتيكي ، في حين يتم ترتيب غلة الكربون الأساسية في خط يشكل إمكانات إلكتروستاتيكية سلبية أقل بروزا بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحديد هيكلي في حوالي أسبوع من وقت الرنين المغناطيسي النووي وبضعة أيام أخرى من العمل من أجل الحصول على مجموعة من التأكيدات التي يمكن استخدامها للتحليل الهيكلي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحليل الطفرات الببتيدية الأخرى والظروف المختلفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تعالج الشروط المطلوبة لدرجات مختلفة من الارتباط وإطلاق أيون النحاس.