تحديد هيكل وتنسيق مجمعات الببتيد المعدنية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي 1D و 2D ¹H

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية ببتيد محاكي لبروتين المرافق المعدني (Metallo chaperone) المرتبط بالنحاس. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير العينة في بيئة خالية من الأكسجين. وتتمثل الخطوة الثانية في الحصول على بيانات مطيافية الرنين المغناطيسي النووي أو NMR التي توضح التفاعلات بين ذرات الهيدروجين.

بعد ذلك، يتم تعيين التفاعلات المكانية على قالب ببتيدي خطي. والخطوة النهائية هي إيجاد بنية ممثلة ذات طاقة منخفضة تتوافق مع البيانات. وفي النهاية، تُستخدم البنى المشتقة من الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد نمط الارتباط وإجراء تحليل بنيوي للمعقد المرتبط بالنحاس.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالتقنيات الحالية، مثل علم البلورات بالأشعة السينية، في إمكانية استخدامها لفحص معقدات الارتباط الضعيفة، وكذلك الجزيئات والمعقدات التي لا تتبلور. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول البروتينات الرابطة للنحاس، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل chaperone المعدنية الأخرى، لدراسة كيفية تمكين البروتينات من التوصيل الآمن لأيونات المعادن الأساسية، والتي قد تكون سامة في بيئة الخط الخلوي.

للبدء، يتم تحضير العينات في بيئة خالية من الأكسجين لمنع أكسدة النحاس؛ ولتحضير عينة APO، أذب ما يقرب من 1 إلى 2 مليغرام من الببتيد في 450 إلى 500 µL من مذيب NMR المديتر (Deuterated) من درجة نقاء NMR. وبالنسبة للعينة المتفاعلة مع النحاس، أذب نفس كمية ببتيد APO مع كمية متساوية مولياً من ملح المعدن في 450 إلى 500 µL من مذيب NMR. قم بترشيح كل محلول باستخدام ورقة ترشيح زجاجية ذات مركز أو أي تقنية أخرى تناسب المركبات قيد الدراسة ولا تمتصها. ويعد ذلك ضرورياً لإزالة أي جسيمات معدنية قد تؤثر على التجانس.

انقل المحاليل إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وأغلق العينات داخل الأنابيب. وقبل مغادرة صندوق القفازات، أخرج العينات منه وأحكم إغلاقها. سجل أطياف البروتون أحادية البعد لعينات APO والعينات المتفاعلة مع النحاس باستخدام جهاز NMR ثم قارن بينهما.

يتسم ببتيد APO بالمرونة ويظهر متوسطاً من التشكيلات، ولكن عند تفاعله مع النحاس، تكتسب أميدات الببتيد المرتبطة بنية أكثر صلابة. وبناءً على ذلك، يجب أن يظهر طيف الببتيد المحتوي على النحاس تغيراً ملحوظاً في الإزاحة الكيميائية في منطقة الأميد، وقد تصبح القمم منفصلة. قم بإعداد تجارب NMR المحسنة من نوع cozy أو tox أو nosy أو rosy تحت ظروف متطابقة كما هو موضح في البروتوكول النصي وقم بتشغيلها بالتسلسل.

أجرِ تجارب أحادية البعد بين كل تجربة وأخرى للتأكد من بقاء تركيب العينة ثابتاً طوال فترة اكتساب البيانات. بعد معالجة البيانات كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بإعداد مجموعة من أطياف COSY و TOCSY متراكبة على طيفي NOESY و ROSY. وذلك لتعيين جميع قمم NOE في الطيف.

ابدأ بتعيين القمم التي تتداخل مع إشارات التكسيس في منطقة بصمة الإصبع. وبما أن هذا سيسهل إدخالات تعيين القمم اللاحقة باستخدام برنامج Sparky، فقم بتسجيل القمم المعينة وتحويل قيم اقتران بروتين H alpha إلى amide إلى زوايا ثنائية السطح. قم أيضاً بتحويل القمم إلى قيود مسافة عن طريق تكامل القمم من داخل البرنامج وتحويلها باستخدام تفاعل ذو مسافة معروفة.

إذا تداخلت القمم أو تعذر استخدام طرق التكامل التلقائي، يمكن تصنيف القمم كقوية، أو متوسطة، أو ضعيفة، أو ضعيفة جداً عن طريق التقدير البصري، ويمكن ترجمة هذه التوصيفات إلى مسافات تصل إلى 2.5 و3.5 و4.5 و5.5 angstroms على التوالي. يتم استيراد قيود المسافة وزوايا الدييدرال بالتنسيق الصحيح لبرنامج explore. وسيقوم برنامج Explore بالبحث في الحيز التشكيلي للعثور على البنى التي تلتزم بالهندسة الكيميائية القياسية.

بالإضافة إلى قيود المسافة التي تم إيجادها تجريبياً لتوليد مجموعة من البنى لا يتم فيها انتهاك أي من هذه المعايير، وهو ما سيشكل المجموعة الأولية. قم بإجراء الجولة الأولى من تحديد البنية دون استخدام أي قيود متعلقة بالمعدن، وذلك لتحديد البقايا التي تشارك في الارتباط بالمعدن دون أي تحيز.

قم بإدخال القيود تدريجياً لتسهيل تحديد الأخطاء في التعيين، بالإضافة إلى طاقة NOE ومعاملات الركوع المحاكاة كما هو موضح في البروتوكول النصي، قبل تقليل البنى باستخدام تقليل الطاقة بالتدرج المترافق لمدة 4,000 تكرار، ثم أنشئ مجموعة نهائية تتكون عادةً من 50 عضواً من خلال إدخال القيود بطريقة تكرارية على المجموعة بأكملها، مع تسجيل عدد كل نوع من تفاعلات NOE التي تم العثور عليها. وأخيراً، أنشئ مجموعة من البنى التي تلتزم بالهندسة الكيميائية القياسية والقيود المستمدة من تجارب NMR التجريبية، مع تسجيل العدد الإجمالي للتشكيلات، وعدد التشكيلات التي تحتوي على انتهاكات للقيود المستمدة من NMR، وقيمة RMSD للمجموعة بأكملها، بما في ذلك قيم RMSD للعمود الفقري وجميع الذرات الثقيلة.

قم بتحليل مجموعة الطاقة المنخفضة وتحديد السلاسل الجانبية للبقايا الموجودة في تقارب صحيح من بعضها البعض لتكون قادرة على ربط أيون المعدن. وبمجرد تحديد هذه البقايا، كرر التحليل مع تضمين بيانات ربط النحاس. وبالإضافة إلى قيود المسافة المستمدة من NMR، أضف الآن قيود ربط المعادن إلى البقايا التي تم تحديدها.

أضف المعاملات المناسبة لوصف أيون المعدن وطوبولوجيته. أدخل المعلومات الفيزيائية المناسبة مثل الكتلة وأطوال الروابط مع الذرات الأخرى، والزوايا، ومعاملات التنافر غير الرابطة في ملف المعاملات. أضف معلومات الارتباط إلى ملف الطوبولوجيا.

تتضمن هذه المعلومات الروابط التي يتم تكوينها وكسرها، والشحنات الرسمية التي تتغير نتيجة للارتباط. وأخيرًا، يتم الحصول على مجموعة من البنى كما سبق، حيث تمثل المجموعة التي تم حلها الفراغ التشكيلي الذي يتخذه الببتيد. وأثناء قياس NMR، يتم استيراد جميع تشكيلات البنية إلى برنامج Mal Mall لإنشاء مجموعة بدائية.

افحص المجموعة لتحديد الاستقرار الموضعي للجزيء. حدد قيم RMSD للعمود الفقري والسلسلة الجانبية عن طريق اختيار مناطق متتالية من أربعة بقايا على طول التسلسل، وجعل البرنامج يحسب RMSD بالنسبة للبنية ذات الطاقة الأدنى أو المتوسط، وحدد المناطق في الجزيء التي تظهر استقراراً موضعياً من خلال رسم RMSD الموضعي كدالة للتسلسل، وقم بتركيب المجموعة فوق هذه المنطقة من الجزيء واستخدم هذه المجموعة لمزيد من التحليل. اختر تشكيلات منخفضة الطاقة تلتزم بالقيود المستمدة من NMR.

ستشكل هذه النتائج سجل المجموعة ذات الطاقة المنخفضة، وستوضح عدد التشكيلات في المجموعة، ومعايير اختيارها، وقيم RMSD. إذا لم يتم تحديد نمط ارتباط المعدن بعد، قم بتحليل المجموعة ذات الطاقة المنخفضة وتحديد السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية غير الصحيحة، ومدى قربها من بعضها البعض لتتمكن من ربط أيون المعدن.

استخدم برنامج KYMERA لتحديد المسافات الجزيئية الداخلية بين الذرات المشتبه في ارتباطها بالفلز. احسب متوسط المسافات في المجموعة بمجرد تحديدها. كرر التحليل مع تضمين بيانات الارتباط بالنحاس.

افحص المجموعة وحدد البنية الثانوية المحلية داخل الجزيء باستخدام معاملات البحث الافتراضية لبرنامج MAL mall. بعد ذلك، استورد المجموعة إلى kymera. وتُثبَّت البنى الثانوية بواسطة الروابط الهيدروجينية وتشير إلى المناطق المستقرة في الجزيء.

تحديد ارتباط الهيدروجين باستخدام أداة kymera. متابعة التحليل البنيوي كما هو مفصل في البروتوكول النصي. ثم تلخيص جميع النتائج البنيوية لتوضيح كيفية تعزيزها لبعضها البعض. ولدراسة نماذج البروتينات المرتبطة بالنحاس، تم تحديد بنية تسلسل الارتباط المحفوظ لبروتين ضمن الببتيد الخطي المشتق عن طريق الرنين المغناطيسي النووي في الحالة السائلة (solution state NMR)، حيث تم فحص منطقة الأميد في الببتيد من 6.7 إلى 8.5.

أظهر PP M توسعاً عند التفاعل مع النحاس ليصل إلى 6.6 إلى 9.0 PP M. ويظهر في خط الأساس اتساع في الخطوط ناتج عن أكسدة طفيفة للنحاس. يوضح الشكل هنا تراكباً لمناطق البصمة الطيفية لأطياف Roy Toxi و cozy للببتيد المرتبط بالنحاس. كانت العينة مستقرة مع مرور الوقت، وكانت الأطياف ذات دقة جيدة وأعطت 81 تفاعلاً من تفاعلات NOE التي تم الحصول عليها من خلال تجربة rosy.

بما أن الجزيء أظهر تفاعلات NOE تقارب الصفر في تجربة NO C، فإن مجموعة الببتيد المستمدة من العينة المتفاعلة، مع عدم استخدام أي قيود على المعدن، أعطت 47 من أصل 50 بنية غير مرتبطة بقيمة RMSD بلغت 1.44 و 2.07 angstroms للهيكل الأساسي والذرات الثقيلة على التوالي. ومن بين هذه البنى، تم اختيار 13 تشكلاً منخفض الطاقة لمزيد من التحليل بقيم RMSD بلغت 0.25 و 0.61 angstroms للهيكل الأساسي والذرات الثقيلة على التوالي. وأظهر مخطط RMSD المحلي منطقة استقرار بين البقايا الثالثة والسابعة؛ وبالإضافة إلى المنطقة الصلبة عند الطرف الكربوكسيلي (C terminal)، والتي تتضمن بقايا prolene، وُجدت هذه المنطقة في هيئة انحناء بين البقايا الرابعة والسابعة في جميع التشكيلات.

يتم استقرار تأكيد الانحناء عن طريق الروابط الهيدروجينية بين المانحات والمستقبلات في العمود الفقري للجزيء لكل من glycine five و three anine two، بالإضافة إلى cysteine six و cysteine three. كما يظهر هذا الانحناء أيضاً في cystine three و sine seven من خلال قيم الاقتران المنخفضة في هذه المنطقة. وقد تم تطبيق التراكبات على هذه المنطقة وتحليلها للبحث عن البقايا الرابطة المحتملة عند اعتبار cystine three و cystine six و methionine one كبقايا رابطة محتملة.

كانت أقصر مسافة بين ذرتي كبريت هي المسافة بين مجموعات الفولات في السيستين 3 والسيستين 6، ثم تم إدخال ارتباط النحاس وتكرار الحسابات للحصول على المجموعة المستخدمة في التحليل. وتظهر مجموعة الطاقة المنخفضة للببتيد المرتبط بالنحاس أن الأمين الطرفي يقع بالقرب من النحاس المرتبط. يظهر هنا السطح متساوي القيم لتوزيع الجهد الكهروستاتيكي، حيث يظهر الجهد الموجب باللون الأزرق والجهد السالب باللون الأحمر.

تمتد بقايا الأرجينين من العمود الفقري للببتيد لتشكل فصًا موجبًا من الجهد الكهروستاتيكي، بينما تترتب ذرات الكربون في العمود الفقري في خط يشكل جهدًا كهروستاتيكيًا سالبًا أقل بروزًا. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء التحديد الهيكلي في غضون أسبوع واحد تقريبًا من وقت الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وبضعة أيام أخرى من المعالجة النهائية للحصول على مجموعة من التكوينات التي يمكن استخدامها في التحليل الهيكلي. وباتباع هذا الإجراء، يمكن تحليل طفرات ببتيدية أخرى وظروف مختلفة للإجابة على أسئلة إضافية تتناول الظروف المطلوبة لدرجات متفاوتة من ارتباط وتحرر أيون النحاس.