الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو دراسة تراكيب التجمعات البروتينية الجزيئية الفائقة غير الذائبة وغير البلورية بدقة ذرية باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة مع تدوير الزاوية السحرية (magic angle spinning solid state NMR spectroscopy). سنعرض الخطوات المنهجية الأساسية لدراسة التراكيب الذرية للتجمعات البروتينية الجزيئية الحيوية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة. وتعد دراسة التراكيب الذرية لهذه التجمعات تحديًا كبيرًا لأنها غير ذائبة وغير بلورية بطبيعتها.

يُعد الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (Solid state NMR) تقنية ناشئة قادرة على دراسة البنية الجزيئية والديناميكيات بدقة ذرية دون التقيد بحجم الجسم المجمّع أو قابليته للذوبان. نوضح هنا الخطوات الرئيسية لتصور البنى الذرية لتجمعات البروتينات الجزيئية الحيوية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة، بما في ذلك تحضير العينات الموصومة نظائرياً، وجمع وتحليل البيانات البنيوية المستخلصة من الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة. وتتمثل الخطوة الأولى في سير عمل الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة في إنتاج وحدات بروتينية فرعية موصومة بـ C13 وN15 وتجميعها في المختبر (in vitro).

قم بتلقيح 15 ml من مزرعة مسبقة من وسط LB المُدفأ مسبقاً بمستعمرة واحدة من خلايا E.coli المحولة. تُحضن المزرعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 200 RPM طوال الليل. ولتلقيح المزرعة الرئيسية، انقل كامل المزرعة المسبقة إلى لتر واحد من وسط N9 المُدفأ مسبقاً والذي يحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين اللازمة والموسومة نظائرياً.

يمكن أن تشمل هذه المواد كلوريد الأمونيوم المسمى بـ N15، أو الجلوكوز المسمى بشكل موحد بـ C13، أو الجلوكوز المسمى انتقائيًا بـ C13، أو الجلسرين المسمى انتقائيًا بـ C13. يتم التحضين عند 37 °C، وقياس الكثافة الضوئية عند 600 nanometers بمجرد أن تصبح المزرعة عكرة. وعندما تصل قيمة OD إلى 0.8، يتم تحفيز التعبير البروتيني باستخدام 0.75 mini molar IPTG لمدة أربع ساعات. يرجى ملاحظة أن ظروف التحفيز المثلى قد تختلف من بروتين إلى آخر.

استعد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 6,000 G ودرجة حرارة 4 °C. بعد تنقية الوحدات الفرعية للبروتين، يتم تجميعها في المختبر (in vitro). ركز البروتين ليصل تركيزه إلى حوالي 1 mM باستخدام وحدة ترشيح طاردة مركزياً.

للقيام بذلك، ضع العينة في وحدة الترشيح ثم قم بالطرد المركزي عند 4,000 G لمدة 30 دقيقة. وبين خطوات الطرد المركزي، امزج المحلول الموجود في وحدة الترشيح برفق باستخدام الماصة لتجنب ترسب البروتين على غشاء الترشيح. كرر هذه العملية حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب.

انقل العينة إلى أنبوب فالكون (falcon tube) واحضنها مع التقليب لمدة أسبوع واحد في درجة حرارة الغرفة. وعادةً ما يصاحب بلمرة الوحدات الفرعية إلى خيوط تحول المحلول إلى الحالة العكرة. أضف أزيد الصوديوم بتركيز 0.02% وزن/حجم لتجنب التلوث البكتيري.

لجمع التجمع البروتيني، قم بطرد العينة مركزياً لمدة ساعة واحدة عند 20,000 G ودرجة حرارة أربع درجات. اسحب معظم السائل الطافي مع ترك كمية كافية فقط لتغطية السطح لتجنب جفاف العينة، واحفظ العينة عند أربع درجات حتى وقت القياس. سنعرض التجارب الأساسية للتحليل البنيوي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (solid state NMR).

تُستخدم تجارب الاستقطاب المتقاطع أحادي البعد (CP)، وتجارب inept التي تم رصدها على نوى C13، للكشف عن قطاعات البروتين الصلبة والمرنة في التجمع، على التوالي. ولتقدير درجة التجانس الهيكلي وتعدد الأشكال الموضعي. وهنا، نستخدم القيم التجريبية القياسية.

توضح البروتوكول نطاقات المعلمات النموذجية. أدخل الدوار في مغناطيس NMR وابدأ الدوران بالزاوية السحرية كما هو موضح في البروتوكول. اضبط تردد الدوران المطلوب، وتأكد من الاستقرار في حدود زائد أو ناقص 10 hertz.

سجّل طيف بروتون أحادي البعد بنبضة واحدة باستخدام 16 مسحة. قم بإعداد تجارب 1D proton carbon CP. تُظهر تجارب CP الإشارات الناشئة عن البقايا ذات التشكيل الصلب. تم أخذ معلمات التجربة الأولية من إجراء تحسين قياسي على مركب مرجعي.

يمكن تحسين معلمات معايرة النبض وفك الاقتران في العينة عندما تكون الحساسية عالية بما يكفي. نقوم هنا بتسجيل CP بـ 16 مسحًا. يتم اختيار وقت تلامس CP ومستويات القدرة بناءً على أقصى كثافة للإشارة، كما هو موضح هنا لتحسين وقت تلامس CP.

يتم الوصول إلى أقصى كثافة في هذا المثال عند 800 milliseconds. كما يجب إعادة ضبط معاملات فك الاقتران (decoupling parameters) بدلاً من تلك التي تم تعيينها أصلاً من معايرة المركب المرجعي. وأخيراً، يجب مراقبة تموضع حزم الدوران الجانبية (spinning side bands) بعناية عند تردد دوران الزاوية السحرية المحدد، الموضح هنا عند 18 kilohertz، لتجنب التداخل مع الإشارة.

قم بتسجيل طيف مرجعي أحادي البعد (1D) لبروتون وكربون باستخدام الاستقطاب المتقاطع (CP) ليكون بمثابة بصمة طيفية أحادية البعد. هنا، نقوم بتجميع 128 مسحاً بزمن تلامس CP قدره 800 millisecond، وقوة فك اقتران تبلغ 100 kilohertz، وفترة تأخير تكرار قدرها ثلاث ثوانٍ، وزمن استحواذ يبلغ 20 milliseconds. قم بمعالجة تجربة CP دون إجراء عملية apathi-zation.

اختر قمة معزولة لتقدير C39 داخل العينة، وهو ما يشير إلى الترتيب الهيكلي والتجانس. هنا، يبلغ عرض الخط، المقاس كالعرض الكامل عند نصف الارتفاع، حوالي 60 إلى 70 hertz، مما يدل على بنية بروتينية جيدة الترتيب في التجمع. قم بإعداد تجربة inept أحادية البعد للبروتون والكربون لاستقصاء الأجزاء عالية الحركة في التجمع البروتيني.

سجّل تجربة inept مرجعية لتكون بمثابة بصمة لقطع البروتين المتحركة. المعلمات النموذجية هي 128 مسحاً، ووقت استحواذ قدره 25 milliseconds. قم بمعالجة تجربة inept للبروتون والكربون.

يشير عدد الإشارات ومواقعها إلى مدى حركية الثمالات وتكوين الأحماض الأمينية على التوالي. هنا، تظهر فقط الإشارة الناتجة عن CH2 في منظم الالتواء (twist buffer) كونه الوحيد الذي يستحق الذكر، حيث يكون البروتين بأكمله في نظام صلب ضمن بنية التجمع. يعتمد التحليل التشكيلي لبنية البروتين على تعيينات الرنين في NMR الحالة الصلبة لجميع الثمالات الصلبة في التجمع.

يتحقق ذلك لأن الإزاحات الكيميائية تُعد مجسات عالية الحساسية للبيئة الكيميائية المحلية، ويمكن استخدامها للتنبؤ بالبنية الثانوية للبروتين. ومن ثم، يعتمد التحديد الكامل للبنية ثلاثية الأبعاد على مجموعة من البيانات البنيوية، مثل قيود المسافة التي تشفر التقاربات الذرية داخل الجزيء وبين الجزيئات حتى تسعة angstrom. سنوضح هنا كيفية تسجيل التجارب ثنائية الأبعاد الأساسية ونقدم مثالاً على التعيين التسلسلي.

سنقوم بعد ذلك بتقديم عرض توضيحي قصير حول كيفية جمع قيود المسافة من التجارب المسجلة على عينات تم وسمها انتقائياً بـ C13. قم بإعداد تجربة PDSD ثنائية الأبعاد للكربون-كربون بزمن خلط قصير للكشف عن ارتباط الكربون-كربون داخل الثمالة الواحدة. انسخ قيم خطوة الاستقطاب المتبادل الأولية بين البروتون والكربون من تجربة CP أحادية الأبعاد.

يمكن ضبط وقت الخلط على 50 مللي ثانية للعينات الموصومة بـ C13 بشكل موحد. في هذه التجربة، اخترنا وقت استحواذ يبلغ 15 و20 مللي ثانية في البعدين غير المباشر والمباشر على التوالي. ولمعالجة طيف PDSD، نستخدم دالة نافذة QSINE مع إزاحة sine-bell قدرها 3.5.

لتمكين التعيين الخاص بالبقايا، استخدم إعدادات تجربة PDSD ذات وقت الخلط القصير لتسجيل تجربة PDSD ذات وقت خلط متوسط يتراوح بين 100 إلى 200 مللي ثانية. لاحظ أن التعيين الكامل للرنين يتطلب غالباً أطيافاً إضافية، بما في ذلك تجارب الكشف عن النيتروجين، وهي مفصلة في البروتوكول. اختر برنامجاً لتحليل NMR، مثل CCPNMR Analysis.

قم بتحميل الأطياف ثنائية الأبعاد (2D spectra) في البرنامج، وأنشئ كائنًا جزيئيًا يحتوي على التسلسل البروتيني الأساسي. ابدأ بتحديد أنواع الأحماض الأمينية المرئية في طيف PDSD ذي زمن الخلط القصير. يتيح ربط ذرات الكربون في أنظمة الغزل إجراء تعيين خاص بنوع الثمالة.

نقوم هنا بتعيين نظام الغزل لبقايا الثينيوم. تؤدي انتقالات الاستقطاب بين نوى C-alpha و C-beta و C-gamma إلى ظهور قمم تقاطعية مادية في طيف PDSD. حاول تحديد أكبر عدد ممكن من البقايا باستخدام هذا الإجراء.

قم بدمج طيفي PDSD لفترتي الخلط القصيرة والمتوسطة. عادةً ما تنشأ القمم الإضافية الظاهرة في طيف PDSD ذي فترة الخلط المتوسطة عن التلامس بين البقايا المتتالية. حدد قمم الرنين لنظام غزل معين وابحث عن الارتباطات في طيف PDSD ذي فترة الخلط المتوسطة مع ترددات الرنين لأنظمة غزل أخرى.

نوضح عملية التعيين المتسلسل من thenium 33 إلى isolutane 32 في تجميع البروتين الخيطي الخاص بنا. تظهر ترددات الرنين لنظام غزل thenium عند تردد كربوني لـ isolutes في 32، والعكس صحيح. يصف البروتوكول إجراءات التعيين باستخدام أطياف الكشف عن النيتروجين وكيفية الحصول على البنية الثانوية للبروتين من عمليات التعيين هذه.

بعد إتمام عملية تعيين الرنين بدقة، يمكننا الانتقال إلى تحديد قيود المدى البعيد. وتتمثل قيود المدى البعيد في تقاربات الكربون-كربون، سواء كانت داخل الجزيء الواحد أو بين جزيئات مختلفة، بين بقايا أحماض أمينية متباعدة، وهي التي تحدد كلًا من الطي الثالثي للوحدات الفرعية أحادية القسيمة وترتيب هذه الوحدات داخل المجمع البروتيني. وهنا، تكتسب العينات المسمىزنة انتقائيًا بنظير C13 أهمية خاصة.

قم بتركيب مخطط توزيع الإزاحات الكيميائية (PDSD) لزمن خلط متوسط مع مخطط PDSD لكربون-كربون بزمن خلط طويل، حيث يتم تسجيل الأخير بزمن خلط يتراوح بين 400 millisecond إلى 1 second على عينة موسومة انتقائيًا بـ C13. ويفضل، إن أمكن، أن يتم تسجيل كلا المخططين (PDSD) على نفس العينة الموسومة انتقائيًا. وتظهر قمم إضافية نتيجة الارتباطات بين ذرات C13 الأكثر تباعدًا.

عند تعيين الرنين، يجب مراعاة مخطط الوسم الانتقائي. في هذه الحالة، 1-3-glycerol. لقد قمنا هنا بتسليط الضوء على مثال لذروة تلامس بعيدة المدى مع تعيين لا لبس فيه في كلا البعدين.

ثريونيوم 33 C-beta مع البروتين 45 C-alpha. بعد استكمال تحديد المسافات طويلة المدى، تُصنف القيود على أنها غير غامضة أو غامضة، وكذلك قيود داخل الجزيء أو بين الجزيئات. وتُدرج قوائم القيود التي يجب إعدادها للنمذجة الهيكلية في البروتوكول.

يمكن العثور على دروس تعليمية حول النمذجة البنيوية باستخدام برامج مختلفة عبر الإنترنت. تتيح بيانات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (Solid state NMR)، سواء بمفردها أو بالاقتران مع بيانات تكميلية، تحديد البنية على المستوى الذري للتجمعات الجزيئية الفائقة. وتتمثل مزايا الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة، من ناحية، في القدرة على توفير معلومات عن البنية الثانوية وقيود المسافات الذرية من الواجهات داخل الجزيئية، والتي يمكن دمجها في عملية النمذجة.

ومع ذلك، تكمن الميزة الفريدة لمطيافية الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (solid state NMR spectroscopy) في قدرتها على جمع قيود المسافة الذرية عند الواجهات بين الجزيئية للتجمعات الجزيئية الفائقة السليمة. ومع ذلك، قد تكون عملية الكشف والتمييز بين تعيينات القيود داخل الجزيئية وبين الجزيئية عملية شاقة، وتتطلب عادةً تحضير عينات موسومة انتقائيًا بـ C13. ولكن، مع التطورات الجديدة في استراتيجيات الوسم الانتقائي، وتصميم أجهزة المطياف، ومنهجيات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة، أصبحت هذه التقنية تحقق بشكل متزايد إمكاناتها النظرية في توفير معلومات جزيئية على المستوى الذري دون قيود تتعلق بحجم الجسم، أو النظام بعيد المدى، أو التبلور.

تتيح لنا هذه الطريقة دراسة البنية الذرية للتجمعات الجزيئية الحيوية. ومن المهم جداً تحضير العينة بعناية لتحسين ظروف الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، وذلك للحصول على بيانات عالية الدقة. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكننا الحصول على دقة ذرية توفر معلومات حول التجمعات البروتينية.

ويمكن دمج هذه التقنية مع تقنيات أخرى في البيولوجيا البنيوية للحصول على نماذج ثلاثية الأبعاد.