الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو دراسة هياكل تجميعات البروتين الجزيئي الفائق غير القابلة للذوبان وغير البلورية بالدقة الذرية عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة بزاوية سحرية. سنقدم الخطوات المنهجية الأساسية لدراسة الهياكل الذرية لتجميعات البروتين الجزيئي الحيوي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة. تعد دراسة الهياكل الذرية لهذه التجميعات أمرا صعبا للغاية لأنها بطبيعتها غير قابلة للذوبان وغير بلورية

الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة هي تقنية ناشئة قادرة على دراسة التركيب الجزيئي والديناميكيات بالدقة الذرية دون أن تكون مقيدة بحجم الجسم المجمع أو قابليته للذوبان. نوضح هنا الخطوات الرئيسية لتصور الهياكل الذرية لتجميعات البروتين الجزيئي الحيوي عن طريق الرنين النووي للحالة المباعة بما في ذلك تحضير العينات المصنفة نظائريا ، وجمع وتحليل البيانات الهيكلية من الحالة الصلبة بالرنين المغناطيسي النووي. تتمثل الخطوة الأولى في سير عمل الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة في إنتاج وحدات فرعية للبروتين المسمى C13 N15 وتجميعها في المختبر.

تلقيح 15 مل مزرعة مسبقة لوسط LB الدافئ مسبقا بمستعمرة واحدة من خلايا الإشريكية القولونية المحولة. احتضن عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة طوال الليل. لتلقيح الثقافة الرئيسية ، انقل الثقافة المسبقة بأكملها إلى لتر واحد من وسط N9 الدافئ مسبقا الذي يحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين الضرورية المصنفة نظائريا.

يمكن أن تشمل هذه ، كلوريد الأمونيوم المسمى N15 ، أو الجلوكوز المسمى C13 بشكل موحد ، أو الجلوكوز المسمى C13 بشكل انتقائي ، أو C13 المسمى الجلسرين بشكل انتقائي عند 37 درجة ، وقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر بمجرد أن تصبح الثقافة عكارة. عندما يصل OD إلى قيمة 0.8 ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين باستخدام IPTG مولار صغير 0.75 لمدة أربع ساعات. لاحظ أن ظروف الحث المثلى يمكن أن تختلف من بروتين إلى آخر.

استعادة الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 6 ، 000 جم وأربع درجات. بعد تنقية الوحدات الفرعية للبروتين ، يتم تجميعها في المختبر. ركز البروتين على حوالي ضرس صغير واحد في وحدة مرشح الطرد المركزي.

للقيام بذلك ، أدخل العينة في وحدة المرشح وجهاز الطرد المركزي عند 4 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة. بين خطوات الطرد المركزي، امزج المحلول برفق في وحدة المرشح باستخدام ماصة لتجنب ترسب البروتين في غشاء المرشح. كرر الإجراء حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب.

انقل العينة إلى أنبوب الصقر واحتضانها تحت التحريك لمدة أسبوع في درجة حرارة الغرفة. عادة ما تكون بلمرة الوحدات الفرعية إلى خيوط مصحوبة بمحلول يصبح عكرا. أضف 0.02٪ الوزن لكل حجم أزيد الصوديوم لتجنب التلوث البكتيري.

لحصاد مجموعة البروتين ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة ساعة واحدة عند 20،000 جم وأربع درجات. استنشق غالبية المادة الطافية مع ترك ما يكفي من السائل فقط لتغطية السطح لتجنب تجفيف العينة ، وقم بتخزين العينة عند أربع درجات حتى القياس. سنقدم التجارب الأساسية للتحليل الهيكلي بواسطة الرنين النووي للحالة الصلبة.

يتم استخدام الاستقطاب المتقاطع أحادي البعد ، أو CP ، والتجارب غير الكفؤة التي تم اكتشافها على نوى C13 للكشف عن أجزاء البروتين الصلبة والمرنة في التجميع ، على التوالي. ولتقدير درجة التجانس الهيكلي وتعدد الأشكال المحلية. هنا ، نستخدم القيم التجريبية القياسية.

يشار إلى نطاقات المعلمات النموذجية في البروتوكول. أدخل الدوران في مغناطيس الرنين المغناطيسي النووي وابدأ دوران الزاوية السحرية كما هو موضح في البروتوكول. اضبط تردد الدوران المطلوب ، وتأكد من التثبيت في حدود زائد أو ناقص 10 هرتز.

سجل طيف بروتون نبضي واحد أحادي البعد باستخدام 16 عملية مسح. قم بإعداد CP كربون البروتون 1D. تظهر تجارب CP الإشارات التي تنشأ من المخلفات في شكل صلب. تؤخذ معلمات التجربة الأولية من إجراء تحسين قياسي على مركب مرجعي.

يمكن تحسين معايرة النبض ومعلمات الفصل في العينة عندما تكون الحساسية عالية بما فيه الكفاية. هنا ، نسجل CP مع 16 عملية فحص. يتم اختيار وقت التلامس CP ومستويات القدرة على أساس شدة الإشارة القصوى، كما هو موضح هنا لتحسين وقت التلامس CP.

يتم الوصول إلى الحد الأقصى للشدة في هذا المثال عند 800 مللي ثانية. وينبغي أيضا إعادة ضبط معلمات الفصل عن تلك التي ضبطت أصلا من معايرة المركب المرجعي. أخيرا ، راقب بعناية توطين النطاقات الجانبية الدوارة عند تردد الدوران بزاوية سحرية معينة ، كما هو موضح هنا عند 18 كيلو هرتز ، لتجنب التداخل مع الإشارة.

سجل طيف الكربون CP المرجعي 1D البروتون الذي يعمل كبصمة طيفية أحادية البعد. هنا ، نقوم بتجميع 128 عملية مسح مع وقت اتصال CP يبلغ 800 مللي ثانية ، وقوة فصل 100 كيلو هرتز ، وتأخير إعادة التدوير لمدة ثلاث ثوان ، ووقت اكتساب يبلغ 20 مللي ثانية. معالجة تجربة CP دون لامبالاة.

اختر وعزل الذروة لتقدير C39 داخل العينة ، مما يدل على الترتيب الهيكلي والتجانس. هنا ، يبلغ عرض الخط ، الذي يقاس بالعرض الكامل عند نصف الارتفاع ، حوالي 60 إلى 70 هرتز ، مما يدل على بنية بروتين منظمة جيدا في التجميع. قم بإعداد تجربة غير كفؤة بالكربون البروتوني أحادي البعد لاستكشاف الأجزاء عالية الحركة من مجموعة البروتين.

سجل تجربة مرجعية غير كفؤة لتكون بمثابة بصمة لقطاعات البروتين المتنقلة. المعلمات النموذجية هي 128 عملية مسح ، ووقت اكتساب يبلغ 25 مللي ثانية. معالجة تجربة الكربون البروتوني غير الكفؤة.

يدل عدد الإشارات ومواقعها على مدى حركة المخلفات وتكوين الأحماض الأمينية على التوالي. هنا ، لوحظت إشارة فقط من المخزن المؤقت الملتوي CH2 merit-y لأن البروتين بأكمله في نظام صلب في هيكل التجميع. يعتمد التحليل التوافقي لبنية البروتين على تعيينات رنين الرنين النووي للحالة الصلبة لجميع المخلفات الصلبة للتجميع.

أصبح هذا ممكنا لأن التحولات الكيميائية هي مجسات حساسة للغاية للبيئة الكيميائية المحلية ، ويمكن استخدامها للتنبؤ بالتركيب الثانوي للبروتين. ثم يعتمد تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد الكامل على جمع البيانات الهيكلية مثل قيود المسافة التي تشفر كلا من القرب بين الذرة داخل الجزيئات وبين الجزيئات حتى تسعة أنجستروم. هنا ، سوف نوضح كيف يتم تسجيل التجارب الأساسية ثنائية الأبعاد ونقدم مثالا على مهمة متسلسلة.

سنقدم بعد ذلك عرضا توضيحيا قصيرا حول كيفية جمع قيود المسافة من التجارب المسجلة على عينات C13 المسماة بشكل انتقائي. قم بإعداد تجربة PDSD ثنائية الأبعاد لكربون الكربون القصير لوقت الخلط للكشف عن ارتباط الكربون داخل البقايا. انسخ قيم خطوة الاستقطاب المتقاطع لكربون البروتون الأولي من تجربة CP أحادية البعد.

يمكن ضبط الخلط على 50 مللي ثانية للعينات الموحدة C13. هنا ، اخترنا وقت اكتساب 15 و 20 مللي ثانية في الأبعاد غير المباشرة والمباشرة على التوالي. لمعالجة طيف PDSD ، نستخدم وظيفة نافذة QSINE مع إزاحة الجرس الجيبي 3.5.

لتمكين تعيين محدد للبقايا، استخدم إعدادات وقت الخلط القصير PDSD لتسجيل PDSD متوسط وقت خلط مع وقت خلط يتراوح من 100 إلى 200 مللي ثانية. لاحظ أن الأطياف الإضافية ، بما في ذلك التجارب المكتشفة بالنيتروجين ، غالبا ما تكون مطلوبة لتعيين رنين كامل ، ويتم تفصيلها في البروتوكول. اختر برنامج تحليل الرنين المغناطيسي النووي ، مثل تحليل CCPNMR.

قم بتحميل الأطياف ثنائية الأبعاد في البرنامج ، وقم بإنشاء كائن جزيئي بتسلسل البروتين الأساسي. ابدأ بتحديد أنواع الأحماض الأمينية المرئية في طيف PDSD القصير لوقت الخلط. يسمح توصيل ذرات الكربون لأنظمة الدوران بتعيين نوع محدد من المخلفات.

هنا ، نقوم بتعيين نظام الدوران لبقايا الثينيوم. يؤدي نقل الاستقطاب بين نوى C-alpha و C-beta و C-gamma إلى قمم متقاطعة فيزيائية في طيف PDSD. حاول تحديد أكبر عدد ممكن من المخلفات باستخدام هذا الإجراء.

تراكب طيف PDSD لوقت الخلط القصير والمتوسط. عادة ما تنشأ القمم التكميلية المرئية في وقت الخلط المتوسط PDSD من التلامس بين المخلفات المتسلسلة. حدد قمم الرنين لنظام الدوران وابحث عن ارتباطات في وقت الخلط المتوسط PDSD مع ترددات الرنين لأنظمة الدوران الأخرى.

نعرض التخصيص المتسلسل مع الثينيوم 33 إلى isolutane 32 في مجموعة البروتين الخيطية لدينا. تظهر ترددات الرنين لنظام دوران الثينيوم على تردد الكربون للعوازل في 32 ، والعكس صحيح. يتم وصف إجراءات التخصيص مع الأطياف المكتشفة بالنيتروجين والحصول على البنية الثانوية للبروتين من التعيينات في البروتوكول.

بعد تعيين الرنين الشامل ، يمكننا المضي قدما في تحديد القيود بعيدة المدى. القيود طويلة المدى هي تقارب كربون كربوني داخل أو بين الجزيئات بين المخلفات البعيدة التي تحدد كلا من الطية الثالثة للوحدات الفرعية الأحادية وترتيب الوحدات الفرعية داخل التجميع. هنا ، تعتبر العينات المسماة C13 بشكل انتقائي ذات أهمية خاصة.

تراكب PDSD وقت خلط متوسط مع وقت خلط طويل من الكربون PDSD المسجل مع وقت خلط يتراوح بين 400 مللي ثانية إلى ثانية واحدة على عينة مسماة C13 بشكل انتقائي. إذا كان ذلك ممكنا ، يجب تسجيل كل من PDSD على نفس العينة المسماة بشكل انتقائي. تنشأ القمم التكميلية من الارتباطات بين ذرات C13 البعيدة.

أثناء تعيين الرنين ، ضع في اعتبارك مخطط الملصقات الانتقائي. في هذه الحالة ، 1-3-جلسرين. هنا ، قمنا بتسليط الضوء على مثال على ذروة الاتصال بعيدة المدى مع وتخصيص لا لبس فيه في كلا البعدين.

ثينيوم 33 سي بيتا مع بروتين 45 سي ألفا. بعد الانتهاء من تحديد المسافة بعيدة المدى ، تصنف القيود على أنها لا لبس فيها أو غامضة وكذلك داخل الجزيئات أو بينها. يتم سرد قوائم التقييد التي سيتم إعدادها للنمذجة الهيكلية في البروتوكول.

يمكن العثور على دروس تعليمية حول النمذجة الهيكلية باستخدام برامج مختلفة عبر الإنترنت. يمكن أن تسمح بيانات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة ، إما بمفردها أو بالاقتران مع البيانات التكميلية ، بتحديد بنية المستوى الذري للتجمعات الجزيئية الفائقة. تتمثل مزايا الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة في القدرة على توفير معلومات الهيكل الثانوي وقيود المسافة الذرية من الواجهات داخل الجزيئات ، والتي يمكن دمجها في عملية النمذجة.

ومع ذلك ، من ناحية أخرى ، تكمن الميزة الفريدة للتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة في قدرته على جمع قيود المسافة الذرية في الواجهات بين الجزيئات للتجميع الجزيئي الفائق السليم. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الكشف والتمييز بين مهام ضبط النفس داخل الجزيئات وبين الجزيئات عملية شاقة ، وتتطلب عادة إعداد عينات مصنفة بشكل انتقائي. ومع ذلك ، مع التطورات الجديدة في استراتيجيات وضع العلامات الانتقائية ، وتصميم أجهزة مطياف ، ومنهجيات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة ، فإن هذه التقنية تحقق بشكل متزايد إمكاناتها النظرية في توفير المعلومات الجزيئية على المستوى الذري دون قيود على حجم الكائن أو الترتيب بعيد المدى أو التبلور.

تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة التركيب الذري للتجمعات الجزيئية الحيوية. من المهم جدا إعداد العينة بعناية لتحسين حالة الرنين المغناطيسي النووي ، للحصول على بيانات عالية الدقة. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا الحصول على الدقة الذرية وهي معلومات عن تجميعات البروتين.

ويمكن دمج هذه التقنية مع تقنيات أخرى في علم الأحياء الهيكلي للحصول على نماذج ثلاثية الأبعاد.