إزالة الخلايا من الرئة غير البشرية للرئيسيات وإعادة الخلايا باستخدام مفاعل حيوي متخصص للأعضاء الكبيرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل المصفوفات البيولوجية للأعضاء بأكملها من رئتي Reus Maccas واستخدام هذه المصفوفات كسقالات للتحقيق في تطبيقات هندسة أنسجة الرئة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا أولا من رئتي Reuss Maca الكاملة بالمنظفات والأملاح والإنزيمات. الخطوة الثانية هي تثبيت سقالات الرئة منزوعة الخلايا في مفاعل حيوي قادر على تهوية مجرى الهواء وتغذية الأوعية الدموية الرئوية بوسائط زراعة الخلايا السائلة.

بعد ذلك ، تجلس سقالات الرئة مع الخلايا الجذعية عبر مجرى الهواء والخلايا البطانية عبر الأوعية الدموية الرئوية. تتمثل الخطوة الأخيرة في زراعة الخلايا داخل سقالة الرئة في ظل ظروف التهوية والتروية التي يوفرها المفاعل الحيوي للفترة الزمنية المطلوبة ، متبوعا بتحليل مورفولوجيا الخلايا والأنسجة الناتجة. في نهاية المطاف ، تؤدي إعادة تكوين سقالات رئة الماكا اللاخلوية بالخلايا الجذعية والخلايا البطانية إلى أنسجة هندسية تحاكي السمات التشريحية والنسيجية لأنسجة الرئة الأصلية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات هندسة أنسجة الرئة ، مثل ما إذا كان يمكن استخدام الخلايا الجذعية أو السلفية لتجديد الأنسجة الرئوية إما بمفردها أو بالتنسيق مع الخلايا الظهارية والبطانية الرئوية الناضجة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أمراض الرئة في المرحلة النهائية لأن مصفوفات الرئة اللاخلوية مع الخلايا الجذعية أو السلفية المشتقة من المريض لديها القدرة على زيادة عدد رئتي المتبرعين المتاحة لزراعة الرئة. علاوة على ذلك ، قد تكون الرئتان الناتجة التي تم تصميمها باستخدام الخلايا الجذعية للمريض مقاومة للرفض المناعي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما شاهدنا مقطع فيديو جو تم نشره سابقا من قبل أعضاء مختبر الدكتورة لورا نيكلسون في جامعة ييل. نقدم هنا تعديلات على إجراءاتهم للقوارض لتناسب احتياجات نموذج Resus Meac الحيواني الكبير. يجب توخي أقصى درجات الحذر لمنع حوادث التعرض المعدي عند العمل مع أنسجة الماكا.

قبل التعامل مع أنسجة الرئيسيات غير البشرية ، ارتد معدات الحماية الشخصية بما في ذلك القناع الجراحي ، ودرع الوجه ، وطبقة واحدة من القفازات الجراحية ، وثوب يمكن التخلص منه ، وطبقة ثانية من القفازات الجراحية مع وضع الرئتين بشكل مسطح في صينية تشريح ، وقم بتقطيع الشريان الرئوي باستخدام موصل إغراء أنثوي بشوكة بحجم مناسب. قم بتثبيت القنية في مكانها برباط بسحاب معقم بالكحول. ضع ربطة عنق بلاستيكية حول القصبة الهوائية.

أدخل موصل إغراء أنثوي في فتحة القصبة الهوائية وشد ربطة العنق المضغوطة حول شوكة الموصل لتثبيت القصبة الهوائية في مكانها حول الشوكة. قم بإزالة الهواء المحبوس من الرئتين عن طريق غرس محلول ملحي مخزن للفوسفات أو PBS يحتوي على 30 وحدة لكل مليلتر من الهيبارين وخمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر من جانب نيتروبريس الصوديوم. يسمح SNP المختصر بطرد المحلول عن طريق الارتداد الطبيعي قبل التكرار.

التثبيت مرتين أخريين بعد تركيب مجرى الهواء الثالث باستخدام حل PBS Heparin SNP. قم بتغطية قنية إغراء القصبة الهوائية بسدادة إغراء. اقطع قمة القلب وقم بري البطينين الداخليين باستخدام PBS Heparin SNP لإزالة تمزق الدم المتبقي كلا الأذينين لتسهيل تصريف الدوائر الرئوية عند التروية.

قم بتوصيل حقنة 60 سم مكعب مملوءة بمحلول PBS Heparin SNP بقنية الشريان الرئوي وقم بإزالة المكبس بعناية للسماح للسائل بالتدفق إلى الأوعية الدموية. قم بإزالة السدادة من قنية القصبة الهوائية والسماح للسائل الموجود في مجرى الهواء بطرد الارتداد الطبيعي. استمر في التروية حتى يتم إزالة أكبر قدر ممكن من الدم من الأوعية الدموية الرئوية.

أصعب جانب في الإجراء هو شطف وغسل مجرى الهواء الرئوي بشكل فعال باستخدام السوائل ، يتم تثبيط تدفق السائل بالنسبة للغازات حيث أن المسالك الهوائية لا تهدف إلى توصيل السوائل ، والوقت والمرضى ضروريون لإنجاز هذه الخطوات ، ننصح بالاستمرار في البروتوكول ، على الرغم من بقاء السائل المتبقي في مجرى الهواء مع تقدم إزالة الخلايا والتخلص من الحطام الخلوي ، ستظل لزوجة السوائل منخفضة وستكون الرئتان قادرة على طرد السوائل بكفاءة في اليوم الأول. اغمر كتلة رئة القلب في ماء منزوع الأيونات ، وقم بتضخيم الرئة ونفخها بالماء منزوع الأيونات باستخدام 60 سم مكعب من المحاقن المتصلة بالقنية القصبية والشريانية المغمورة على التوالي. كرر غسل مجرى الهواء والأوعية الدموية بالماء منزوع الأيونات بشكل فعال.

أربع مرات أخرى ليصبح المجموع خمس مرات من 0.5 إلى لتر واحد تقريبا كل منها بعد خمس غسلات ، قم بإزالة الرئتين من الماء وغمر الكتلة في محلول تريتون. تضخيم ونشر الرئتين بمحلول تريتون. كما كان من قبل ، كرر التثبيت مرة ثانية واحتضان الأعضاء المغمورة في محلول تريتون طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة طوال الليل ، قم بإزالة كتلة الرئة من محلول Triton واغسلها خارجيا بالماء منزوع الأيونات. ثم غمر الكتلة في ماء عذب منزوع الأيونات. غرس الماء منزوع الأيونات في القصبة الهوائية والشريان الرئوي خمس مرات لغسل محلول تريتون وحطام الخلايا.

قم بإزالة الرئتين من الماء منزوع الأيونات واغمرها في 2٪ طبقة ديوكسي الصوديوم أو محلول SDC. تضخيم ونشر بمحلول SDC بنفس الطريقة. اغمر الرئتين في محلول SDC طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم الثالث.

اغسل الأنسجة مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات خارجيا ومن خلال مجرى الهواء والأوعية الدموية خمس مرات. كما كان من قبل ، قم بإزالة الأنسجة من الماء منزوع الأيونات واغمرها في محلول كلوريد الصوديوم المولي الواحد. تضخيم ونفخ بمحلول كلوريد الصوديوم كما كان من قبل ، واغمر الأنسجة في محلول كلوريد الصوديوم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد غسل الرئتين نظيفتين من محلول كلوريد الصوديوم بخمس شطف من الماء منزوع الأيونات.

كما كان من قبل ، استحمهم بمحلول الحمض النووي الطازج وغرس هذا المحلول في مجرى الهواء والأوعية الدموية. احتضان الرئتين في محلول الحمض النووي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة الرئتين من محلول الحمض النووي واغسلها خارجيا بمحلول PBS.

اغمر الرئتين في محلول PBS واغسل هذا المحلول خمس مرات من خلال مجرى الهواء والأوعية الدموية. كما كان من قبل ، قم بتخزين الرئتين في محلول PBS في وعاء محكم الغلق طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم الرابع. اغسل الرئتين بمحلول PBS البارد الطازج خمس مرات من خلال مجرى الهواء والأوعية الدموية.

ثم قم بتخزينها في محلول PBS في وعاء معقم محكم الغلق عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. قم بتجميع مكونات المفاعل الحيوي تحت غطاء تدفق رقائقي وفقا للتخطيط. في بروتوكول النص ، املأ الغرفة الرئيسية بوسط الاستزراع الذي تم موازنته مع 5٪ CO2 جو لحاضنة زراعة الخلايا مباشرة قبل استخدامها في المفاعل الحيوي ، وقم بتطبيق محولات قنية القصبة الهوائية والأوعية الدموية على قنية الرئة.

قم بتثبيت الأعضاء في غرفة المفاعل الحيوي الرئيسية عن طريق استحمام الرئتين في وسط الاستزراع وربط محولات القنية بالمنافذ المناسبة في الغطاء المعدل. بمجرد التوصيل ، قم بتثبيت الغطاء بإحكام وإحكام. لن يتم فتح الغرفة مرة أخرى طوال مدة استنشاق الهواء من الأنبوب باستخدام منافذ الحقنة وحقنة 60 CCC مزودة بإبرة قياس 18 تحرك اتجاه الديوك ثلاثية الاتجاهات لتوجيه تدفق السائل إلى المحقنة.

انقل غرف المفاعل الحيوي المختومة المتصلة بشكل متجاور مع الأعضاء المثبتة إلى حاضنة زراعة الأنسجة لموازنة درجة الحرارة والغاز. قم بتهوية الرئتين باستخدام مضخة حقنة متصلة بالغرفة الرئيسية في نفس كامل واحد تقريبا كل دقيقتين ، وقم بنشر الأوعية الدموية عبر المضخة التمعجية بحوالي 10 ملليلتر في الدقيقة لما مجموعه 30 دقيقة لجلوس مجرى الهواء. قم بتضخيم الرئتين بتعليق الخلية عن طريق الحقن برفق من خلال منفذ المحقنة المتصل بقضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات في حلقة التنفس.

امسك الرئتين بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها بدون مجرى الهواء أو نضح الأوعية الدموية للسماح للخلايا بالالتصاق بمصفوفة الرئة منزوعة الخلايا. بعد الحضانة الليلية ، أعد بدء برنامج تهوية مجرى الهواء القياسي والثقافة ، والأعضاء لمدة ثلاثة إلى سبعة أيام للجلوس الوعائية. يمكن تغيير اتجاه مسار التدفق من الغرفة الرئيسية إلى خزان الجلوس البطاني عن طريق تدوير الصمام الموجود على قضيب التوقف الموجود في الأنبوب الذي يربط هاتين الجزأين بخلايا بطانة البذور تدريجيا باستخدام المضخة التمعجية أثناء التحريك برفق باستخدام التحريك المغناطيسي عند اكتمال البذر.

الدوس على التروية وتحتضن بشكل ثابت لمدة أربع إلى ست ساعات تقريبا. إعادة بدء نضح الأوعية الدموية مع وسط الغرفة الرئيسية بمعدل حوالي 10 ملليلتر في الدقيقة. استزراع لمدة ثلاثة إلى سبعة أيام مع نضح الأوعية الدموية المستمر بالتزامن مع فترة زراعة تهوية مجرى الهواء.

طوال عملية إزالة الخلايا ، أظهرت رئتا MCCA تبييضا تدريجيا بلغ ذروته في مظهر شفاف في نهاية العملية. ومع ذلك ، حافظت الرئتان على سماتها التشريحية الإجمالية وظلت مرنة إلى حد كبير وقادرة على إنتاج ارتداد طبيعي بعد التضخم بالسائل. على المستوى المجهري.

ظل الهيكل الفائق النسيجي سليما بعد إزالة الخلايا. هذا هو الشعب الهوائية التنفسية القصبية الأكياس السنخية. كانت الأوعية الدموية والشعيرات الدموية لا تزال قابلة للتمييز بوضوح تام عن طريق الفحص المجهري منخفض الطاقة.

ومع ذلك ، أظهر التشريح الدقيق النسيجي أنه في حين أن التشريح الإجمالي والبنية الفائقة للرئة كانا مضطربين بشكل معتدل بسبب إزالة الخلايا ، فإن الأنسجة تفتقر تماما إلى الخلايا السليمة كما هو موضح هنا. بقيت كميات ضئيلة فقط من الحمض النووي في الأنسجة منزوعة الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الحمض النووي النزرة ، الذي كان يتركز عن طريق ترسيب الكحول وتم تصوره في هلام AROS بنسبة 0.8٪ ، يتكون في الغالب من شظايا متدهورة منخفضة الوزن الجزيئي.

تم تقييم كفاءة إزالة البروتين الخلوي من خلال تحليلات اللطخة الغربية لكل من بروتين الرئة الأصلي ومنزوعة الخلايا. المحلل باستخدام جسم مضاد لبيتا أكتين ، تم اكتشاف بيتا أكتين بسهولة في محللات الرئة الأصلية ، ولكن ليس في محللات الرئة منزوعة الخلايا مما يشير إلى أن إزالة الخلايا استنفدت الخلايا بشكل كبير وإزالة مادة البروتين المرتبطة بالخلية بعد 14 يوما من بذر مجرى الهواء باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع عظم الماكا أو BMCs وثقافة المفاعل الحيوي مع دورة انتهاء صلاحية واحدة تقريبا كل دقيقتين. تم تقسيم حمة رئتي الماكا منزوعة الخلايا بشكل فعال.

تصطف BMCs على الحاجز السنخي مع الحفاظ على تجويف سنخي واضح ومفتوح. تم أيضا تقسيم المصفوفة المجردة من الشعب الهوائية الكبيرة بواسطة BMCs باستخدام المفاعل الحيوي ، وكان السطح اللمعي للقصبات الهوائية الجذعية الرئيسية مبطنا بطبقة أحادية من الحرشفية مثل BMCs بعد 14 يوما من الاستزراع. في المفاعل الحيوي الموضح هنا ، يوجد فص رئة ريوس منزوع الخلايا بعد خمسة أيام من بذر الأوعية الدموية بالخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة وتوفير نضح الأوعية الدموية المستمر مع وسط الثقافة البطانية بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة.

كشف التحليل النسيجي عن خلايا تبطن الأوعية الدموية الصغيرة في حمة الرئة. في بعض الحالات ، بدا أن الخلايا مرتبطة بالمصفوفة عبر العديد من الإسقاطات الخلوية عبر التجويف ، بينما أظهرت المقاطع العرضية الأخرى للأوعية خلايا تبطن سطح البطانة بالتجويف الصافي. باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية ، واللطخة الغربية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت الخلايا الجذعية المصنفة تتمايز إلى خلايا سلالة رئوية بمجرد زراعتها على مصفوفة الرئة اللاخلوية أو مع الخلايا الظهارية والبطانية الناضجة داخل المفاعل الحيوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدينا فهم جيد لكيفية إزالة الخلايا من رئتي الرئيسيات غير البشرية وبالتالي استخدام الرئتين اللاخلويتين الناتجة كسقالات لزراعة الخلايا الجذعية والخلايا الظهارية والخلايا البطانية في نظام المفاعل الحيوي. لا تنس أن العمل مع أنسجة الرئيسيات غير البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية الكاملة ، بما في ذلك واقي الوجه وطبقة مزدوجة من قفازات اللاتكس أو النتريل أثناء تنفيذ هذا الإجراء.