دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير نموذج كبد ثلاثي الأبعاد لدراسة الفيروسات والنواقل الفيروسية. تسمح هذه الطريقة بدراسة العمليات البيولوجية في نظام ثلاثي الأبعاد وعائي مع خلايا بشرية تختلف في فسيولوجيتها عن خلايا القوارض في نموذج الفأر أو الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، فهي خطوة لتحسين رعاية لأنها تتجنب التجارب على الحية وتهدف ، على المدى الطويل ، إلى استبدال المكونات الحيوانية بالكامل.

على الرغم من أننا طورنا هذه الطريقة لدراسة النواقل الفيروسية لنقل الجينات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة الفيروسات الحيوية المعدية ومجالات البحث الأخرى مثل أبحاث السرطان. ستظهر الإجراء فيولا روهرز ، فنية من مختبري. من أجل رعاية ، تم استخدام الفائضة فقط في الدراسة الحالية التي تم التضحية بها لتجارب حيوانية أخرى ، أي

لم تكن هناك حاجة إلى إضافية للحصول على سقالات الكبد. للبدء ، قم أولا بتوسيع خط الخلايا الكبدية Hep G2. بذر 15 مليون خلية في زجاجات T175 في 30 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل عجل الجنين ومليل اثنين من الجولاتمين والبنسلين والستربتومايسين. بعد أربعة أيام من الاستزراع ، استخدم خمس دقائق من التعرض لمحلول التربسين في ظروف الاستزراع لفك الخلايا ، ثم حصادها.

ثم قم بتدوير الخلايا عند 300 جي لمدة ثلاث دقائق. ثم أعد تعليقها في أربعة ملليلتر من PBS واحصل على عدد الخلايا. يجب أن تنتج كل زجاجة حوالي 45 مليون خلية.

هناك حاجة إلى 600 مليون خلية لإعادة خلية ECM لكبد الفئران. لإعادة خلية ECM ، قم أولا بإعداد نظام المفاعل الحيوي الذي يحتوي على غرفة وفرة الكبد ، ونظام وفرة ، وخزان متوسط ، ومصيدة فقاعات. هناك خطوتان حاسمتان لإجراء إعادة الخلية.

الأول هو تجنب محاصرة أي فقاعات هواء في نظام الوفرة. والثاني هو أن النظام بأكمله يجب أن يظل معقما. أولا ، قم بتعقيم هذه المكونات من نظام المفاعل الحيوي عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثانيا ، املأ الأنابيب وغرفة الوفرة المعقمة بالمتوسط. ثم ضع سقالة كبد الفئران منزوعة الخلايا في غرفة وفرة الكبد. الخطوة التالية هي استخدام مشابك الأنبوب لتوصيل الوريد البابي المقدس بنظام الوفرة.

الآن ضع نظام المفاعل الحيوي في الحاضنة وقم بتوصيله بمضخة تمعجية. بعد ذلك ، قم بموازنة السقالة ب 150 مل من الوسط المكمل على مدار خمسة أيام. اضبط التدفق على 1.25 مل في الدقيقة.

بعد خمسة أيام ، افصل نظام المفاعل الحيوي عن المضخة وانقله إلى غطاء معقم. افصل سقالة الكبد عن دائرة الوسائط. ثم قم بتحميل حقنة بخمسة ملليلتر من الوسط الذي يحتوي على 300 مليون خلية Hep G2 وحقن الخلايا عبر الوريد البابي ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.

ثم اسمح للخلايا بإعادة ملء وحدة التحكم في المحرك لمدة ساعة دون تشغيل المضخة. بعد ساعة ، ابدأ المضخة بمعدل 1.25 مل في الدقيقة. بعد 10 دقائق ، قم بزيادة الضغط إلى 2.5 مل في الدقيقة.

بعد 20 دقيقة أخرى ، اضبط المضخة على سرعة التشغيل البالغة 3.75 مل في الدقيقة. بعد 30 دقيقة بسرعة المضخة الكاملة ، قم بإيقاف تشغيل المضخة ، وأضف 300 مليون خلية أخرى ، واترك الخلايا تملأ ECM لمدة ساعة. بعد ساعة ، قم بزيادة الدورة الدموية تدريجيا عن طريق التعديلات التدريجية على سرعة المضخة كما كان من قبل.

الآن دع الثقافة تعيد خلية الكبد على مدار أسبوعين. كل يومين ، استبدل 50 مل من الوسط وقم بقياس المعلمات الفسيولوجية من عينة من الوسط المستخدم. يعد إنتاج نواقل AAV إجراء معقدا يتضمن العديد من الخطوات التي يتم تلخيصها في بروتوكول النص.

في هذا القسم من الفيديو ، يتم عرض بعض الخطوات الحاسمة. أولا ، قم بإنتاج ونقيته وتحديد نواقل AAV. قم بإنتاج نواقل AAV لفترة وجيزة في زجاجات الأسطوانة وتنقيتها عن طريق الطرد المركزي المتدرج لليوديكسانول.

قم بإزالة اليوديكسانول المتبقي عن طريق الترشيح فوق أعمدة ترشيح هلام PD10. ثم حدد تركيز ناقل AAV بواسطة QPCR باستخدام الحمض النووي الجيني AAV كمعيار. هناك حاجة إلى ما مجموعه 27 تريليون متجه AAV لكل نموذج.

الآن تحويل نموذج الكبد. أولا ، احصل على 27 تريليون ناقل في خمسة ملليلتر من PBS محملة في حقنة. يمكن إضافة الفينول الأحمر بمعدل 5 ميكروغرام لكل ملليلتر.

ثم افصل الكبد عن دائرة الوسائط وحقن النواقل في النظام. بمجرد الحقن ، احتضان النظام لمدة ساعة واحدة دون ضخ. ثم قم بزيادة التدفق تدريجيا كما هو موضح سابقا.

في وقت لاحق ، عندما يتم تحضين الكبد المحول على مدار ستة أيام ، قم بتغيير 50 مل من الوسط كل يومين. باستخدام مشرط، قم بتقطيع عينات من كل فص كبد يبلغ سمكها حوالي نصف سنتيمتر وطولها من 1.5 إلى سنتيمترين. احتضان الشرائح في 4٪ بارافورمالدهيد مع 4٪ سكروز لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

ثم اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. اتبع الغسالات عن طريق احتضان العينات طوال الليل في 8٪ سكروز عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتحميل العينات في قوالب التبريد التي تحتوي على بعض وسائط التثبيت.

تجنب إدخال أي فقاعات هواء. بمجرد التحميل ، قم بتغطية العينات بالكامل بوسيط التثبيت وضعها عند سالب 80 درجة مئوية. بمجرد التجميد ، قم بإعداد عمليات القطع بالتبريد بحجم 10 ميكرون من العينات باستخدام التبريد.

تلطخ العينات حسب الحاجة لتأكيد إعادة الخلية. لتحليل التعبير الجيني ، خذ عينات باستخدام خزعة بأربعة ملليمترات. لتقييم إعادة الخلايا ، تم تلطيخ عمليات الاستئصال بالتبريد بالهيماتوكسيلين واليوزين.

الفصوص من كبدين محولين وكبد تحكم واحد تم إعادة خلوته ولكن لم يتم تحويله بخلايا Hep G2. تم قياس تعبير الحمض النووي الريبي وعيار المتجه من 28 خزعة لكمة من كل نموذج كبد. في نموذجي الكبد المنقولين ، تم قياس 55 و 90 جينوم متجه لكل خلية ، وهو ما يكفي من المتجه للحث على إسكات الجينات.

لم يتم قياس الجينوم في الضابطة ، كما هو متوقع. تم تحليل تعبير EmGFP بواسطة RT-PCR والنشاف الغربي. أظهرت معظم الخزعات تعبير mRNA عن EmGFP والتعبير البروتيني عن EmGFP.

أظهر الوضع المناعي للعمليات البردية أنه أينما تم إعادة إعادة خلية النموذج بنجاح ، يمكن أيضا رؤية تعبير EmGFP. هذا يدل على التعبير الجيني الجيد عن AAV. بعد ذلك ، تم تحليل الضربة القاضية بوساطة AAV للسيكلوفيلين البشري B بواسطة RT-PCR الكمي.

كان متوسط ضربة قاضية من السيكلوفيلين البشري B بين 70 و 90٪ على جميع فصوص الكبدين المنقولين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة توزيع الفيروسات والنواقل الفيروسية في نظام الأعضاء الوعائي ثلاثي الأبعاد. ستساعد مثل هذه الدراسات على تحسين التقنيات الحالية لنقل الجينات وتساعد على تطوير استراتيجيات جديدة مضادة للفيروسات.