الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة طعوم وعائية ذات أساس بيولوجي باستخدام نظام مفاعل حيوي نبضي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير سِقالة قابلة للتحلل الحيوي من شبكة PGA حيث ستنمو الخلايا، ثم تجميعها في غرفة مفاعل حيوي. بعد ذلك، يتم استزراع السقالات بخلايا العضلات الملساء، ويُغلق غطاء مزود بفتحات للهواء وأنابيب تغذية غرفة المفاعل الحيوي.

يتم بعد ذلك توصيل المفاعل الحيوي بنظام تدفق لتوفير تدفق نبضي للأوعية الموجودة داخل المفاعل الحيوي. وفي المفاعل، تنمو الخلايا لتشكل أوعية تجتاز الاختبارات المناعية الكيميائية والكيميائية الحيوية والميكانيكية. وتمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج مرض الشريان التاجي لأن هذه التقنية تعد نهجاً واعداً لتجديد طعوم وعائية صغيرة القطر قابلة للزرع لعمليات تحويل مسار الشرايين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الهندسة الوعائية، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة أعضاء أخرى تخضع لقوى فسيولوجية دورية. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، حيث ستتطلب إتقان هذه المهارات بشكل كامل الكثير من الممارسة.

لقد جاءتنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما أدركنا أهمية تطبيق التحفيز الميكانيكي الفسيولوجي لتجديد البنى الهندسية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن عمليات المفاعل الحيوي يصعب تعلمها نظراً لتعدد خطواتها، ولا يمكن اكتسابها إلا من خلال عرض تفصيلي. للبدء، استخدم الماء المقطر لتنظيف مقاطع بطول 30 centimeter من أنابيب السيليكون ذات القطر الداخلي 3 millimeter واتركها لتجف في الهواء.

استخدم مقصاً لقص قطعة من شبكة PGA بمقاس 1.1 centimeter في 8 centimeter لكل قطعة من الأنابيب، وباستخدام ملقط جراحي (hemostat)، قم بتثبيت شبكة PGA على الأنابيب باستخدام خيط جراحي من نوع Dexon 6.0؛ اربط ثلاث عقد جراحية ثم اتبعها بغرز مفردة باستخدام الملقط الجراحي، وبذلك تشكل الشبكة المثبتة سقالة PGA. اغسل السقالات عن طريق غمرها أولاً في هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 molar لمدة دقيقة إلى دقيقتين، ثم اغمرها ثلاث مرات في ماء مقطر لمدة دقيقتين في كل مرة. جففها بالتربيت بين عمليات الغسل، واتركها تجف في الهواء داخل غطاء سحب الدخان (hood) لمدة 15 minutes بعد الغسلة الثالثة.

بمجرد الجفاف، قم بخياطة أطواق Dacron بطول سنتيمتر واحد على كل طرف من أطراف الشبكة باستخدام ثلاث غرز. اترك تداخلاً في الأنابيب بمقدار اثنين إلى ثلاثة مليمترات واحرص على عدم ثقب الأنابيب. تأكد من ترك حوالي 15 سنتيمتر من الخيوط الحرة لاستخدامها لاحقاً في هذا البروتوكول.

يتم تعقيم جميع مكونات وأدوات المفاعل الحيوي باستخدام الموصدة (autoclave) مسبقاً. وفي اليوم الذي يسبق بدء استنبات المفاعل الحيوي، يجب تجميع المفاعل جزئياً، ثم غمر مكونات المفاعل الحيوي، بما في ذلك السقالات، والشبكات، وأنابيب السيليكون، والأدوات الجراحية، وسلك رفيع يكون طوله أكبر من طول المفاعل الحيوي، في حمام من الإيثانول بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة على الأقل أثناء الغمر. استخدم السلك لسحب أنابيب السيليكون عبر الأذرع الجانبية للمفاعل.

الآن، قم بإخراج المفاعل الحيوي وتثبيت سقالات PGA بالداخل عن طريق ربط أطواق Dacron فوق الحواف الزجاجية المتسعة. استخدم خيوط الجراحة الزائدة لربط كل طوق بإحكام. بعد ذلك، وباستخدام الوصلات، قم بتوصيل أنابيب السيليكون الموجودة على أحد جانبي السقالة بزوج واحد من أذرع المفاعل الحيوي، ووصل الأنابيب الموجودة على الجانب الآخر من السقالة بالذراعين الآخرين.

عندما يتم تركيب الموصلات، اسحبها من الأذرع الجانبية وقم بشطف المفاعل الحيوي باستخدام الإيثانول. اترك المفاعل ينقع لمدة 10 دقائق لكل جانب. ضع المفاعل الحيوي على بعض أطباق بتري وقم بشطفه باستخدام وسط زراعة الأنسجة.

قم بتصريف المياه. باستخدام الماصة، تأكد أيضاً من غسل الشبكة والأنابيب. الآن ضع قضيب تحريك معقماً في المفاعل لاستخدامه لاحقاً، وجفف الجهاز طوال الليل في غطاء التدفق مع تشغيل المنفاخ وإطفاء الأشعة فوق البنفسجية من هذه النقطة فصاعداً.

تجنب الانحناء فوق المفاعل لأن ذلك قد يؤدي إلى حدوث تلوث. أثناء عملية الإعداد، يجب مسح جميع الموصلات جيداً باستخدام الكحول. وقبل إجراء التوصيلات، يتم تعزيز العديد من الوصلات باستخدام البارافورم، والذي يجب نقعه في 70%ethanol قبل استخدامه. لذا، تأكد من توفر كميات كافية من كليهما.

كإجراء وقائي، ضع طبق بتري معقم فوق كل فتحة من فتحات المفاعل الحيوي لحماية سِقالة PGA الموجودة بالداخل من الملوثات. ابدأ الآن بعملية الإعداد عن طريق توصيل منفذ الحقن بالذراع الثالث غير المستخدم في المفاعل الحيوي. بعد ذلك، قم بتوصيل كيس المحلول الوريدي بنظام التدفق.

باستخدام مجموعة أنابيب walrus، اربط الطرف الأزرق في أقرب نقطة ممكنة من وصلة Y ثم أغلق الأنبوب بالمشبك. قم بتوصيل الأنبوب الأحمر بالطرف البعيد من كيس المحلول الوريدي IV bag. بعد ذلك، قم بتوصيل الأنبوب الأبيض بأحد جانبي نظام التدفق.

أدخل صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات في نظام التدفق. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب محول الضغط بصنبور الإيقاف، ووصل الطرف الآخر بالفتحة الوسطى لكيس المحلول الوريدي. والآن، لملء نظام التدفق جزئياً والتحقق من عدم وجود تسريبات، أضف 350 milliliters من PBS و 1%fungi zone إلى كيس المحلول الوريدي.

باستخدام محقنة سعة 60 milliliter قبل أو بعد توصيلها بنظام التدفق، قم بضبط الصمام للتحكم في اتجاه تدفق PBS واضغط على الكيس لغسل النظام. يمكن القيام بهذه الخطوة إما قبل أو بعد ترسيب الخلايا. الآن يمكن ترسيب الخلايا في المفاعل الحيوي.

في هذا المثال، قم بإعادة تعليق 8 مليون من خلايا SM، وهو ما يعادل تقريباً طبق T 75 متراصاً، في 1.25 milliliters من الوسط الغذائي، ثم قم بتقطيرها بشكل متجانس فوق ساند PGA من وصلة Dacron إلى وصلة Dacron. بعد إضافة الخلايا، امسح حافة المفاعل الحيوي جيداً باستخدام الكحول. تجنب الانحناء المباشر فوق المفاعل.

بعد ذلك، قم بتجميع غطاء السدادة المصنوع من السيليكون بعناية. تأكد من عدم تعريض الجزء السفلي من الغطاء للهواء عند إخراجه من كيس التعقيم (autoclave bag) أو خلال أي من خطوات التركيب التالية. أولاً، قم بتوصيل منفذ الحقن بأنبوب التغذية عند الموصل الذكري.

ثانيًا، قم بتثبيت مرشحات PTFE بمسامية 0.20 micron في كل من المنافذ الثلاثة. ثالثًا، قم بتغليف منفذ الحقن. أدخل غطاء السدادة السيليكونية المجمّع في المفاعل الحيوي الزجاجي.

تأكد من أن أنبوب التغذية لا يلامس سقالات PGA المستقرة. بعد ذلك، يتم الإغلاق بإحكام باستخدام البارافورم. الآن قم بتوصيل المفاعل الحيوي بنظام التدفق، وضع المفاعل الحيوي ونظام التدفق داخل حاضنة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius.

يجب وضع المفاعل على جانبه وتدويره كل خمس دقائق لمدة تتراوح من 25 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك، وبينما لا يزال المفاعل داخل الحاضنة، املأ غرفة المفاعل الحيوي بـ 400 milliliters من أوساط زراعة four to 10 باستخدام مضخة عبر أنبوب تغذية. الآن، تُحضن السقالات الملقحة دون أي ضخ نبضي لمدة تتراوح من ستة إلى سبعة أيام عند 37 °C مع 5% carbon dioxide.

لا داعي لتغيير الوسط أو إضافة فيتامين C خلال هذه الفترة. وقبل تشغيل المضخة، افحص الأنابيب للتأكد من عدم وجود تسريبات أو التواءات. ثم اضبط معدل سرعة المضخة للحفاظ على نطاق ضغط يتراوح بين 30- و 270 millimeters of mercury. وراقب هذا الضغط وحافظ عليه يومياً طوال فترة الاستنبات.

يجب إجراء تغييرات الوسط الغذائي وإضافة حمض الأسكوربيك مرتين أسبوعياً أثناء نمو السقالة مع الضخ النبضي لتغذيتها بوسط جديد أولاً؛ قم بتوصيل منفذ الحقن ومرشح PTFE على أغطية التغذية لأغراض تغيير الوسط والتخلص من نفايات الوسط الغذائي. بعد ذلك، ضع أنبوب التغذية بإحكام في المضخة ثنائية الاتجاه وأدخل أحد طرفيه في منفذ تغذية المفاعل الحيوي والطرف الآخر في غطاء التغذية. الآن ابدأ ببطء في ضخ 200 milliliters من الوسط الغذائي للخارج.

يمكن زيادة سرعة المضخة تدريجياً. بعد ذلك، يتم تركيب أنبوب تغذية جديد والبدء ببطء في ضخ 200 milliliters من الوسط الغذائي الطازج. ولإضافة حمض الأسكوربيك إلى المفاعل، يتم سحب 25 milliliters من الوسط الغذائي باستخدام حقنة معقمة سعة 30 milliliter.

أضف خمسة مليلتر من محلول حمض الأسكوربيك المعقم ثم أعد 25 مليلتر. ستظهر الأوعية المهندسة في الوسط معتمة وتصل سماكة جدارها إلى 250 ميكرون تقريباً بعد ثمانية أسابيع من الزرع. وتحت ظروف النبض، يُظهر صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين للأوعية المهندسة تغيرات في مورفولوجيا الأنسجة مع مرور الوقت ومع النبض.

يُشار إلى الجانب اللمعي للأوعية الدموية بالحرف L في صبغة Masson's trichrome. وبالنسبة للكولاجين، تظهر الأوعية التي تعرضت لنبضات لمدة أربعة أسابيع كمية أكبر من الكولاجين مقارنة بنظيراتها غير النابضة، بينما تشير الأسهم البيضاء إلى بقايا شظايا PGA في الأوعية بحلول الأسبوع 12. ويظهر التحليل المناعي الكيميائي تعبير مؤشر العضلات الملساء المبكر alpha actin، ومؤشر العضلات الملساء المتوسط calponin 1، ومؤشر العضلات الملساء المتأخر myosin heavy chain. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون سبع إلى ثماني ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أداء جميع الخطوات بأقصى قدر ممكن من النظافة والتعقيم باتباع هذا البروتوكول. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تعديل تجويف الأوعية المهندسة، للإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية تعديل السطح التجويفي في الحفاظ على الأوعية المهندسة خلال الدراسات الحية (in vivo) بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة، وخاصة الهندسة الوعائية، لاستكشاف السبل المحتملة لعلاج أمراض الشرايين التاجية في النماذج الحيوانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على طعوم وعائية هندسية قابلة للزرع من خلال استزراع ديناميكي لاحق. لا تنسَ أن التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء واقي العينين ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.