الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة الطعوم الوعائية البيولوجية باستخدام نظام مفاعل حيوي نابض. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير سقالة قابلة للتحلل من شبكة PGA حيث تنمو الخلايا في صف وتجميعها في غرفة المفاعل الحيوي. ثم يتم وضع السقالات بخلايا عضلية ملساء وغطاء بالهواء وأنبوب التغذية يغلق غرفة المفاعل الحيوي.

ثم يتم توصيل المفاعل الحيوي بنظام تدفق لتوفير تدفق نابض للأوعية الموجودة في المفاعل الحيوي. في المفاعل ، تنمو الخلايا إلى أوعية تجتاز اختبارات كيميائية مناعية وكيميائية حيوية وميكانيكية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مرض الشريان التاجي لأن هذه التقنية هي نهج واعد لتجديد الطعوم الوعائية ذات القطر الصغير القابلة للزرع لتحويل مسار الشرايين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لهندسة الأوعية الدموية ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة الأعضاء الأخرى مثل القوى الفسيولوجية الدورية. بشكل عام ، سوف يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة. سوف تحتاج إلى الكثير من الممارسة لإتقان المهارات بشكل كامل.

خطرت لنا فكرة هذا النهج لأول مرة عندما أدركنا أهمية تطبيق التحفيز الميكانيكي الفسيولوجي لتجديد التركيبات الهندسية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم عملية غناء المفاعل الحيوي نظرا لوجود العديد من الخطوات ولا يمكن الحصول عليها إلا من خلال عرض توضيحي مفصل. للبدء ، استخدم الماء المقطر لتنظيف أقسام بطول 30 سم من أنابيب السيليكون ذات القطر الداخلي ثلاثة ملليمترات واتركها تجف في الهواء.

استخدم المقص لقطع قسم 1.1 سم × ثمانية سنتيمترات من شبكة PGA لكل قطعة من الأنابيب باستخدام مرقئ ، لذا فإن شبكة PGA إلى الأنبوب باستخدام خياطة Dexon 6.0 تربط ثلاث عقدة جراحية وتتبعها بغرز مفردة مع مرقئ ، تصنع الشبكة الآمنة سقالة PGA. اغسل السقالات عن طريق غمسها أولا في هيدروكسيد الصوديوم المولي لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، ثم ثلاث غموسات في الماء المقطر لمدة دقيقتين لكل غطس. جففها بالتربيت عليها بين الغسلات واتركها تجف في الهواء لمدة 15 دقيقة بعد الغسيل الثالث.

بمجرد أن تجف ، قم بخياطة أصفاد Dacron بطول سنتيمتر واحد على كل طرف من طرفي الشبكة بثلاث غرز. اترك تداخلا بين الأنابيب من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات ولا تثقب الأنبوب. تأكد من ترك حوالي 15 سم من الخيط الحر لاستخدامه لاحقا في هذا البروتوكول.

يتم تجميع جميع مكونات وأدوات المفاعل الحيوي مسبقا. في اليوم السابق لبدء ثقافة المفاعل الحيوي ، يجب تجميع المفاعل الحيوي جزئيا ، وغمر مكونات المفاعل الحيوي والسقالات ، لذلك شبكة أنابيب السيليكون والأدوات الجراحية وسلك رفيع أطول من طول المفاعل الحيوي في حمام الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 دقيقة على الأقل أثناء الغمر. استخدم السلك لسحب أنبوب السيليكون من خلال الأذرع الجانبية للمفاعل.

الآن اخرج المفاعل الحيوي وقم بإرفاق سقالات PGA بالداخل عن طريق تثبيت أصفاد Dacron على الشفاه الزجاجية المتوهجة. استخدم الخيط الزائد لربط كل صفعة. بعد ذلك ، باستخدام الموصلات ، قم بتوصيل أنبوب السيليكون على جانب واحد من السقالة بزوج واحد من أذرع المفاعل الحيوي وقم بتوصيل الأنبوب على الجانب الآخر من السقالة بالذراعين الآخرين.

عند تثبيت الموصلات ، اسحبها من الأذرع الجانبية واغسل المفاعل الحيوي بالإيثانول. اترك المفاعل منقوعا لمدة 10 دقائق على كل جانب. ضع المفاعل الحيوي على بعض أطباق بتري وقم بإخراجه بزراعة الأنسجة.

الصف المياه. باستخدام ماصة ، تأكد أيضا من طرد الشبكة والأنبوب. الآن ضع قضيب تحريك معقم في المفاعل لاستخدامه في المستقبل وجفف الجهاز طوال الليل في غطاء المحرك مع تشغيل المنفاخ وإيقاف تشغيل الأشعة فوق البنفسجية من هذه النقطة فصاعدا.

لا تتكئ على المفاعل لأن ذلك قد يؤدي إلى التلوث أثناء الإعداد ، يجب مسح جميع الموصلات بالكحول. قبل عمل المرفقات ، يتم بعد ذلك تقوية العديد من المفاصل بالشكل, والتي يجب نقعها في 70٪ الإيثانول قبل تطبيقها. لذلك لديك الكثير من الاثنين.

في حالة الاستعداد كإجراء احترازي ، ضع طبق بتري معقم فوق كل فتحة مفاعل حيوي لحماية سقالة PGA بالداخل من الملوثات. ابدأ الآن الإعداد عن طريق توصيل منفذ الحقن بالذراع الثالث غير المستخدم للمفاعل الحيوي. بعد ذلك ، قم بتوصيل الكيس الوريدي بنظام التدفق.

باستخدام مجموعة أنابيب الفظ ، اربط الطرف الأزرق بالقرب من تقاطع Y قدر الإمكان وقم بتثبيت الأنبوب. قم بتوصيل الأنبوب الأحمر بالطرف البعيد من الكيس الوريدي. ثم قم بتوصيل الأنبوب الأبيض بجانب واحد من نظام التدفق.

أدخل قضيب إيقاف ثلاثي الاتجاهات في نظام التدفق. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب محول الضغط بقضيب التوقف وقم بتوصيل الطرف الآخر بالفتحة الوسطى للكيس الوريدي. الآن لملء نظام التدفق جزئيا والتحقق من وجود تسريبات ، أضف 350 مل من PBS و 1٪ منطقة فطريات إلى الكيس الوريدي.

باستخدام حقنة سعة 60 مليلتر قبل أو بعد توصيل نظام التدفق ، اضبط محبس التحكم في اتجاه تدفق PBS واضغط على الكيس لشطف النظام. يمكن القيام بهذه الخطوة إما قبل أو بعد الجلوس في الخلية. الآن يمكن الجلوس في المفاعل الحيوي.

في هذا المثال ، يعلق resus 8 ملايين خلية SM ، أي حوالي ملتقى T 75 في 1.25 ملليلتر من الوسط ويقطرها بشكل موحد على سقالة PGA من تقاطع Dacron إلى تقاطع Dacron. بعد إضافة الخلايا ، امسح حافة المفاعل الحيوي نظيفة بالكحول. تجنب التحليق فوق المفاعل.

بعد ذلك ، قم بتجميع غطاء سدادة السيليكون بعناية. تأكد من عدم كشف الجزء السفلي من الغطاء عند إزالته من كيس الأوتوكلاف أو أثناء أي من خطوات التثبيت التالية. أولا ، قم بتوصيل منفذ الحقن بأنبوب التغذية عند موصل الذكور.

ثانيا ، قم بإرفاق مرشحات PTFE 0.20 ميكرون بكل مطار من المطارات الثلاثة. الفقرة الثالثة ، قم بتصوير منفذ الحقن. أدخل غطاء سدادة السيليكون المجمع في المفاعل الحيوي الزجاجي.

تأكد من أن أنبوب التغذية لا يلمس سقالات PGA الجالسة. ثم ختم مع الشكل. الآن قم بتوصيل المفاعل الحيوي بنظام التدفق وضع المفاعل الحيوي ونظام التدفق داخل حاضنة 37 درجة مئوية.

لمدة 25 إلى 30 دقيقة ، يجب وضع المفاعل على جانبه وتدويره كل خمس دقائق. بعد ذلك ، بينما لا تزال في الحاضنة ، املأ غرفة المفاعل الحيوي ب 400 مل من أربعة إلى 10 وسائط استزراع باستخدام مضخة من خلال أنبوب تغذية. الآن احتضان السقالات المصنفة دون أي ضخ نابض لمدة ستة إلى سبعة أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ليست هناك حاجة للتغيير المتوسط أو مكملات فيتامين سي خلال هذا الوقت قبل تشغيل المضخة ، افحص الأنبوب بحثا عن التسريبات أو مكامن الخلل. ثم اضبط معدل سرعة المضخة للحفاظ على نطاق ضغط يتراوح بين سالب 30 و 270 ملم من الزئبق. راقب هذا الضغط وحافظ عليه يوميا في جميع أنحاء الثقافة.

يجب إجراء التغييرات المتوسطة ومكملات حمض الأسكوربيك مرتين في الأسبوع بينما تنمو السقالة مع الضخ النابض لتغذية الوسط الطازج أولا ، وتوصيل منفذ الحقن ومرشح PTFE بأغطية التغذية لأغراض التخلص من النفايات المتوسطة والمتوسطة. بعد ذلك ، ضع أنبوب التغذية بإحكام في المضخة ذات الاتجاه المزدوج وأدخل أحد طرفيه في منفذ التغذية للمفاعل الحيوي والطرف الآخر في غطاء التغذية. الآن ابدأ ببطء في ضخ 200 مل من المتوسط.

تدريجيا يمكن زيادة سرعة المضخة. ثم قم بتوصيل أنبوب تغذية جديد وابدأ ببطء في ضخ 200 مل من الوسط الطازج. لإضافة حمض الأسكوربيك إلى المفاعل ، قم بإزالة 25 مل من الوسط باستخدام حقنة معقمة سعة 30 مل.

أضف خمسة ملليلتر من محلول حمض الأسكوربيك المعقم ثم أعد 25 ملليلترا. ستبدو الأوعية الهندسية المتوسطة غير شفافة وتحقق سمك جدار يبلغ حوالي 250 ميكرون بعد ثمانية أسابيع من الاستزراع. في ظل ظروف النبض ، يظهر تلطيخ الهيمات والتوين واليوزين للأوعية المصممة هندسيا تغيرات مورفولوجيا الأنسجة بمرور الوقت ومع النبض.

يشار إلى الجانب اللموعي للأوعية بصبغة L masson's tri CHRO. بالنسبة للكولاجين ، فإن الوعاء النبضي لمدة أربعة أسابيع يحتوي على كولاجين أكثر من نظيره غير النبضي ، وتشير الأسهم البيضاء إلى شظايا PGA المتبقية في الأوعية الدموية لمدة 12 أسبوعا. يظهر التحليل الكيميائي المناعي التعبير عن علامة العضلات الملساء المبكرة ألفا أكتين ، وعلامة العضلات الملساء الوسيطة كال بوين واحد ، وعلامة العضلات الملساء المتأخرة ، السلسلة الثقيلة من الميوسين بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون سبع إلى ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ كل شيء بشكل نظيف وصارم قدر الإمكان باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تعديل تجويف الأوعية الهندسية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية تعديل السطح اللمعي في صيانة السفن الهندسية أثناء الدراسات في الجسم الحي. بعد تطويره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة ، وخاصة هندسة الأوعية الدموية ، لاستكشاف الوسائل المحتملة لعلاج أمراض الشريان التاجي في النماذج الحيوانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق ترقيع الأوعية الدموية للمهندس القابل للزرع من خلال ثقافة بريدية ديناميكية. لا تنس أن العمل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل حماية العين ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.