تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مستوى الجلوكوز داخل الخلايا أو الجلوتامين بشكل غير جراحي باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على البروتين المشفرة وراثيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل الخلايا ذات الأهمية أولا بجين المستشعر الحيوي الذي يحتوي على البلازميد واختيار تلك الخلايا التي تعبر عن المستشعر الحيوي. في الخطوة الثانية ، يتم أخذ عينات من زراعة الخلايا من مزارع الدفعات أو الدفعات المغذية ويتم قياس نسب الحنق الخاصة بها.

يمكن بعد ذلك تحديد تركيز الجلوكوز أو الجلوتامين داخل الخلايا للعينات عن طريق اختبار مستقل. في النهاية ، يمكن استخدام نسبة الحنق للعينات لحساب تركيز الجلوكوز أو الجلوتامين داخل الخلايا بشكل غير جراحي وفي الوقت الفعلي. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحسين العمليات الحيوية لأن هذه طريقة موثوقة للحصول على معلومات التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي التي يمكن استخدامها للتحسين والتحكم عبر الإنترنت.

على الرغم من أنه يمكن استخدام الطريقة لتوفير نظرة ثاقبة للمعالجة الحيوية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في أنظمة أخرى ، بما في ذلك استشعار علامات المرض. ابدأ بإحياء خلايا CHO في تسعة ملليلتر من وسط النمو الكامل. ثم قم بتدوير الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من النمو الجديد ، والمتوسط ، وعد الخلايا عن طريق الكرشة في استبعاد القالب الأزرق.

بعد ذلك ، ابدأ مزرعة بكثافة بذر ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في 125 ملليلترا. قوارير شاكر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون على منصة اهتزاز مدارية. مع دوران 125 دورة في الدقيقة ، قم بزراعة الخلايا كل ثلاثة إلى أربعة أيام في وسط النمو الكامل بكثافة جلوس مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر لتعداء الخلية.

حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 24 ساعة قبل التعدي للتأكد من أن الخلايا تنقسم بنشاط. ثم بعد تحضير الحمض النووي البلازميد ، قم بحساب الخلايا عن طريق استبعاد الكرشة والقالب الأزرق وقم بتخفيف الخلايا إلى حجم عمل يبلغ 20 مل من وسائط زراعة الخلايا. في 125 ملليلتر ، رج القارورة بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

استخدم مجموعة تعداء مناسبة لخط الخلية قيد الاستخدام ، بما في ذلك بئر تحكم سلبي واحد على الأقل يحتوي على خلايا ، ولكن لا يوجد حمض نووي. احتضان الخلايا المنقولة لمدة أربعة أيام في الوضع الثابت. أضف الآن المضاد الحيوي المناسب لاختيار البلازميد إلى تركيز مناسب على النحو الذي يحدده منحنى القتل.

على سبيل المثال ، في هذه الدراسة ، تمت إضافة الزين إلى التركيز النهائي البالغ 400 جرام لكل مليلتر لاختيار الخلايا المنقولة ثم نقل الثقافات إلى منصة اهتزاز تدور بسرعة 125 دورة في الدقيقة. قم بتغيير الوسائط في فاصل زمني مناسب لخط الخلية ، مع إضافة المضادات الحيوية في كل مرة حتى تموت الخلايا الموجودة في بئر التحكم. استخدم الآبار الأكثر التقاء للتقدم إلى الثقافات المهتزة.

ثم قم بتجميد الخلايا في قوارير مبردة تحتوي على واحد في 10 إلى السابع الخلايا القابلة للحياة في مليلتر واحد من مزيج التجميد لتوليد منحنيات نمو الدفعة وتغذيتها. أولا ، قم بإنشاء مزارع خلوية ثلاثية لخلايا CHO المنقولة في قوارير اهتزاز سعة 250 مليلتر بحجم عمل يبلغ 50 ملليلترا. ثم ضع المزارع في حاضنة خلايا مرطبة مع رج وإزالة عينات 4.1 مليلتر من كل مزرعة متنامية على فترات 24 ساعة بالنسبة لمزارع الدفعات الفيدرالية ، استكمل الخلايا بالكمية المناسبة من الجلوكوز أو الجلوتامين في اليوم السادس لاستعادة تركيزاتها إلى قيمها الأولية.

عند تغذية مزارع التحكم بنفس الحجم من الماء النقي ، استخدم 100 ميكرولتر من عينات 4.1 مليلتر من 4.2 يوميا لحساب الخلايا عن طريق الرحلة واستبعاد القالب الأزرق حتى يتم تقليل تركيز الخلية القابلة للحياة إلى الصفر. لتحديد قياسات نسبة الحنق ، يقوم جهاز الطرد المركزي بملليلترين من العينات اليومية وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلترين من PBS المثلج ، ونقل نصف تعليق الخلية إلى صفيحة بستة آبار وإضافة عينة فارغة لا تحتوي على خلايا إلى واحدة. حسنا ، قم على الفور بقياس مستويات التألق الأزرق والأصفر بطول موجي للإثارة يبلغ 430 مع عرض نطاق ترددي يبلغ 35 نانومتر وأطوال موجية للمهمة تبلغ 465 بعرض نطاق ترددي يبلغ 35 نانومتر و 520 مع عرض نطاق ترددي يبلغ 10 نانومتر للمضان الأزرق والأصفر على التوالي.

احسب نسب الحنق عن طريق تحديد نسبة التألق الأصفر المكتشف إلى نسبة التألق الأزرق. الآن قم بتدوير آخر ملليلترين من العينات اليومية ثم اغسل الحبيبات مرتين في برنامج تلفزيوني مثلج بعد الغسيل الثاني. قم بإجراء صوت عينة خمس مرات لمدة ثلاث دقائق في كل مرة بنبض 15 ثانية وإيقاف تشغيله لمدة 15 ثانية.

أخيرا ، قم بإجراء فحوصات المستقلب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واستخدم المنحنيات القياسية الناتجة لحساب مستويات الجلوكوز أو الجلوتامين داخل الخلايا حسب الاقتضاء. في هذه التجربة التمثيلية ، تم الحفاظ على الثقافات المتضخمة للدفعات من خطين من الخلايا كما هو موضح للتو مع العينات اليومية المستخدمة للمعايرة في الجسم الحي لكل فيب. يتم عرض ملف تعريف نمو الخلية التمثيلي القابل للحياة لخطي الخلايا فيما يتعلق بمستويات الجلوكوز أو الجلوتامين داخل الخلايا في هذا الرسم البياني ويتم عرض قياسات الحنق المقابلة وتركيزات المستقلب داخل الخلايا التي تحددها المقايسات الأنزيمية في هذا الجدول.

تقرر أن أعداد الخلايا المنخفضة الموجودة في الأيام الأربعة الأولى من الثقافة أدت إلى إشارة حنق غير موثوقة. وبالمثل ، فإن المستوى العالي من محللة الخلية الموجود بعد اليوم الثامن من الثقافة أنتج كمية عالية من تشتت الضوء. لذلك ، يتم استخدام بيانات الأيام من الرابع إلى الثامن فقط لبناء منحنيات المعايرة لألويقان الجلوكوز والجلوتامين.

تشير النتائج إلى أن إشارة FIB تنتج ارتباطا موثوقا به مع التركيزات داخل الخلايا بين واحد وخمسة مللي مولار للجلوكوز و 0.3 ومليمولار للجلوتامين. للتحقق من صحة نتائج الفيجانيات ، تم إجراء مزارع متضخمة لخطي الخلايا. تم استكمال العلف الذي يحتوي على تركيز ركيزة عال في اليوم السادس من زراعة الخلية لرفع تركيزات الركيزة خارج الخلية.

نظرا لأن الطعوم تصور نسب الحنق في كل يوم تظهر استجابة واضحة للتغذية. من خلال عكس الاتجاه ، تابعوا حتى اليوم السادس. على سبيل المثال ، في الثقافات التي تغذى على الجلوكوز ، زاد تركيز الجلوكوز خارج الخلية مرة أخرى حتى 36 ملليمول.

أثناء وجوده في المزارع التي تتغذى على الجلوتامين ، زاد تركيز الجلوتامين إلى أربعة مللي مولار. في تجربة الجلوكوز ، انخفضت نسبة الحنق لخط الخلية المختار من الجلوكوز في اليوم السابع استجابة لإضافة الجلوكوز. نظرا لأن اللوفانيات الجلوكوز تتبع APO عند التكوين.

وبالمثل ، في تجربة الجلوتامين ، زادت نسبة الحنق لخيوط الجلوتامين المختارة لخط الخلية استجابة لإضافة الجلوتامين بما يتماشى مع مبدأ أجهزة استشعار إيقاف تشغيل APO. تم استخدام قياسات الحنق هذه أخيرا لحساب تركيزات الجلوكوز والجلوتامين داخل الخلايا المقابلة بناء على منحنيات المعايرة المذكورة أعلاه. تتم مقارنتها بالتركيزات الفعلية داخل الخلايا لهذه الركائز كما هو محدد باستخدام فحوصات الجلوكوز والجلوتامين الأنزيمي ، وتظهر اتفاقا كافيا بعد تطوره.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال استكشاف تأثير تركيبات الوسائط المختلفة على إنتاجية البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لمراقبة تركيزات المستقلب داخل الخلايا.