التصوير متحد البؤر الفاصل الزمني كما وسيلة فعالة لتقييم Cytocompatibility من المركبات الأسنان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ثلاثي الأبعاد للتصوير بفاصل زمني لتقييم التوافق الحيوي في المختبر نوعيا وكميا لمركبات الأسنان. يتم تحقيق ذلك عن طريق أخذ عينات كروية من مركب الأسنان غير المعالج أولا في الخطوة الثانية. يتم زراعة الخلايا الليفية اللثوية البشرية في وجود أو عدم وجود هذه المستخلصات المركبة ، ثم يتم تصنيف الخلايا بتلطيخ حي ميت.

ثم يتم إنشاء صور الخريطة لمزارع الخلايا ويتم إنشاء صور متراكبة لمناطق الاهتمام. في النهاية ، يمكن مراقبة الاختلافات في الوقت الفعلي في سلوك الخلية التي تحدث في وجود أو عدم وجود المركبات المختبرة وفقا للتغيرات في إشارات الفلورسنت الخضراء أو الحمراء التي لوحظت في الصور. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية في أنها تسمح بالمراقبة في الوقت الفعلي للخلايا الحية دون إحداث تغييرات في بنية الخلية.

لا يلزم إجراء خطوات تثبيت أو تجفيف بعد تلطيخ الخلية أو قبل مراقبة الفاصل الزمني. لتحضير المستخلص المركب ، ابدأ باستخدام حامل مخصص بنصف قطر ملليمترين لتشكيل عينات كروية من مركب الأسنان غير المعالج. انقل العينات إلى آبار فردية من صفيحة من ستة آبار تحتوي على مليلتر واحد من وسط الاستزراع ، مع الحرص على ترك بعض الآبار مع وسائط بمفردها لمزارع الخلايا الضابطة ، ثم ترتيب مصباح LED بكثافة 1070 مللي واط سنتيمتر مربع في حدود 0.5 ملم من العينات.

عالج العينات لمدة 40 ثانية لمحاكاة التلامس المؤقت بين الأسنان ومركب الأسنان غير المعتنى به ، ثم احتضان العينات المركبة لمدة 24 ساعة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام وقم بتمرير الخلايا كل خمسة أيام. ثم بعد أن تصل الثقافة إلى الطلاقة ، قم بحصاد الخلايا وتدويرها لمدة خمس دقائق عند 90 مرة جم وعند 37 درجة مئوية.

أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع ، ثم بعد عد الخلايا ، قم بزرع معلق الخلية بكثافة خلية 2.5 أضعاف 10 إلى الخلايا الرابعة لكل مليلتر في نظام منزلق الغرفة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. في صباح اليوم التالي ، استبدل الوسائط في بئرين من شريحة الغرفة بمليلتر واحد من المستخلصات المركبة المختبرة ، ثم ضع الشريحة مرة أخرى في الحاضنة لتصوير الخلايا عن طريق الكونفوكال. التصوير بفاصل زمني.

قم أولا بتسمية الخلايا المزروعة المشتركة والتحكم في الخلايا ذات صبغة السمية الخلوية الميتة الحية للخلايا حقيقية النواة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد 15 دقيقة من التلوين ، ضع شريحة الغرفة في الظلام في الغرفة المتكاملة متحدة البؤر في ظل ظروف زراعة الخلايا وقم بتسخين الليزر 473 نانومتر و 559 نانومتر. بعد ذلك ، استخدم كاشفا مع طيف مطور حديثا لضبط ظروف التصوير تلقائيا لليزر 473 نانومتر.

استخدم وظائف التأطير والتكبير/التصغير لتحديد منطقة الاهتمام، ثم اختر وضع المراقبة. حدد ما يصل إلى خمسة أنواع من أوضاع المراقبة ، بما في ذلك Zack بفاصل زمني ومناطق متعددة حسب الحاجة ، ثم التقط بسرعة خمس صور خريطة باستخدام ليزر 473 نانومتر تحت هدف 10 × لكل من عينة الاختبار وخلايا التحكم عند الحصول على الصور المطلوبة. قم بالتبديل إلى الليزر 559 نانومتر والتقط صورا للخلية عند الفلورسنت الثاني كما هو موضح للتو.

بدلا من ذلك ، قم بتراكب صور الفلورسنت وتباين الضوء باستخدام النقطة المحددة على الشاشة الحية X 60 لمراقبة مخزن الصور الحية. صور الخريطة بتنسيق صورة أوليمبوس لتحليل الإشارات وصور الإسقاط القصوى هي 24 بت لكل بكسل. ثم تستخدم ملفات TIFF أدوات التحليل المختلفة لقياس ملف تعريف شدة الإشارة ونسبة الشدة بين قناتي الفلورسنت.

أخيرا ، قم بتحليل الاختلافات في إشارات الخلية الفلورية بين المجموعتين باستخدام البرنامج المناسب. في هذه الصور الخريطة لخلايا بقع TED الحية في الوسائط وحدها أو المعرضة للمستخلص المركب ، لم يلاحظ أي اختلافات في صلاحية الخلايا بعد 15 دقيقة من فترة الفاصل الزمني. هنا ، تظهر صور الإسقاط القصوى لخلايا التحكم المصير المكبر للخلايا خلال أول 15 دقيقة وبعد خمس ساعات في نهاية فترة الفاصل الزمني كما لوحظ ، لم يكن هناك اختلاف كبير في التألق داخل خلايا التحكم خلال فترة الحضانة.

افترضت الخلايا المعرضة للانكماش المنخفض للغاية ELS مورفولوجيا مغزل مماثلة لخلايا التحكم ، لكنها أظهرت انخفاضا طفيفا في إشارة الفلورسنت الخضراء وزيادة طفيفة جدا في التألق الأحمر في نهاية فترة الفاصل الزمني. يتم توضيح ملف تعريف شدة الخلايا الملطخة في هذه الرسوم البيانية حيث تم قياس شدة انبعاث بطانة الكالسيوم المتجانسة على الخلايا الضابطة والمكشوفة المركبة على فترات ساعة واحدة لمدة تصل إلى خمس ساعات. لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية في الإشارات بين الثقافتين.

عرض نسب الجدوى للخلايا المركبة الضابطة والمكشوفة في الجدول. في وجود المركب المختبر ، وجد أن النسبة المئوية للخلايا الحية تنخفض بشكل طفيف من 100 إلى 93.9٪ بعد ساعة واحدة من الاتصال بعد خمس ساعات. لوحظت اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية بين مركب ELS المختبر ، والانكماش المنخفض للغاية ومزارع خلايا التحكم السلبية على الرغم من عدم السمية الخلوية للمركب.

تسلط البيانات الحالية الضوء على استخدام التصوير بفاصل زمني متحد البؤر كطريقة دقيقة وحساسة لتقييم سلوك الخلايا الليفية العامة عند ملامسة مركبات الأسنان بعد تطورها. هذه الطريقة طريقة خاصة للباحثين في مجال علم السموم لاستكشاف السمية الخلوية وتقييم مخاطر مواد طب الأسنان والأدوية والمواد الكيميائية والأجهزة الطبية الأخرى.