الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ومقارنة التوزيعات ثلاثية الأبعاد المتزامنة لثلاثة مكونات خلوية وخارج الخلية الأغشية الحيوية بعد العلاج بعوامل مضادة للبكتيريا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع العينات المركبة من الراتنج أولا ثم تلميعها. في الخطوة الثانية ، تزرع الأغشية الحيوية ذات الأهمية على العينات ثم تعالج بعوامل مضادة للبكتيريا.

بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية بالفلوروكرومات للمواد البوليمرية خارج الخلية والأحماض النووية والبروتينات ، ثم يتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر. في الخطوة الأخيرة ، يتم إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد للفلوروكرومات المتراكبة لتسهيل التصور المتزامن لمكونات الأغشية الحيوية ويتم حساب المعلمات الهيكلية من صور الأغشية الحيوية. في النهاية ، يمكن إجراء تحليل إحصائي للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية مثل الحجم الحيوي ومتوسط سمك الأغشية الحيوية لمقارنة الاختلافات بين مجموعات المعالجة والمجموعة الضابطة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا الإجراء على الطرق الحالية في أنه يستخدم تقنيات متميزة ولكنها مترابطة لتوصيف توزيع مكونات متعددة داخل بنية الأغشية الحيوية المزروعة في ظل ظروف محددة ، مما يدل على أن الإجراء سيكون الدكتور فرناندو فلوريس ، زميل أبحاث ما بعد الدكتوراه ، والسيدة كريستين سمارت ، مساعدة باحثة من مختبري لإنشاء العينات تبدأ بوضع زيادة واحدة قدرها 0.4 أو TPH ثلاثة مركب راتنج الأسنان في العرف مصنوعة قوالب من الفولاذ المقاوم للصدأ. بعد ذلك ، قم ببلمرة الزيادة الأولى باستخدام وحدة معالجة ضوء LED لمدة 40 ثانية. بعد تكرار الإجراء للزيادة الثانية ، استخدم ملمع مطحنة شبه آلي لتلميع العينات المعالجة إلى تشطيب نهائي مقبول للسطح.

أخيرا ، قم بتعقيم العينات لزراعة الأغشية الحيوية. أولا ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من الطفرات S في أربعة ملليلتر من وسط الاستزراع بين عشية وضحاها ، ثم احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة لتحقيق كثافة بصرية لا تقل عن 0.9. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة بنسبة واحد إلى 100 في 10 مل من نمو الأغشية الحيوية.

ينقل المتوسط عينات مركبة الراتنج المعقم بشكل معقم إلى 12 لوحة بئر معقمة ، ثم يضيف 2.5 مل من الثقافة المخففة إلى كل بئر. بالنسبة لعلاج غسول الفم ومجموعات التحكم ، أضف 2.5 مل من نمو الأغشية الحيوية المعقمة غير الملقحة ، المتوسطة إلى آبار التحكم في العقم ، ثم قم بزراعة الأغشية الحيوية عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف شبه الطعامية الدقيقة على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة. بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط من جميع الآبار وغسل كل بئر مرتين ب 2.5 مل من PBS المعقم الذي يستنشق المحلول الملحي بعد كل غسلة ، ثم قم بتجديد كل بئر ب 2.5 مل من وسائط نمو الأغشية الحيوية الطازجة واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة إضافية كما هو موضح للتو لنمو الأغشية الحيوية الإجمالي مدة 48 ساعة بعد اكتمال نمو الأغشية الحيوية ، استنشق وسط النمو ثم قم بتوزيع 2.5 مل من غسول الفم في كل مجموعة معالجة جيدا و 2.5 مل من الماء المعقم فائق النقاء في المجموعة الضابطة.

بتحريك الألواح جيدا على شاكر مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة ، ثم بعد 60 ثانية ، قم بشفط كل من غسول الفم والماء عالي النقاء من الآبار لتلطيخ مكون عديد السكاريد الخارجي في الأغشية الحيوية. احتضان كل غشاء حيوي ب 50 ميكرولترا من LOR المترافق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. ثم اغسل العينات مرتين باستخدام 2.5 مل من المخزن المؤقت TC الذي يتم شفطه بعد كل غسلة وقم بتلطيخ الأحماض النووية في كل غشاء حيوي بقطرة 50 ميكرولتر من cyto nine لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.

بعد غسل العينات مرتين ، قم بتلطيخ مكونات البروتين في كل غشاء حيوي ب 50 ميكرولترا من Cipro red لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. بعد غسل العينات ثلاث مرات ، انقلها إلى آبار فردية من صفيحة من ستة آبار تحتوي على ستة ملليلتر من الماء المعقم عالي النقاء لكل بئر لتسهيل تصورها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للحصول على صور لكل من البقع المكونة داخل الأغشية الحيوية لمجموعات المعالجة والسيطرة. اضبط ليزر مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر على الإعدادات التالية للكشف عن السكريات الخارجية بواسطة صبغة Exor المترافقة ، واستخدم ليزر 633 نانومتر ونطاق انبعاث 659 إلى 749 نانومتر للكشف عن الأحماض النووية بواسطة صبغة cyto nine.

استخدم ليزر 488 نانومتر ونطاق انبعاث من 495 إلى 500 نانومتر ، ولاكتشاف البروتينات بواسطة صبغة Cipro الحمراء ، استخدم ليزر 543 نانومتر ونطاق انبعاث من 615 إلى 651 نانومتر. ثم باستخدام عدسة غمس 63 × بفتحة عددية 0.9 ومسافة عمل تبلغ 2.2 ملم. اجمع صور المسح المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر بسرعة 400 هرتز باستخدام المسح المتسلسل في وضع ما بين الأكوام لتحسين التقاط صور البقع المتعددة داخل نفس الأغشية الحيوية.

بعد تحليل صور الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، استخدم خيار قائمة العارض ثلاثي الأبعاد في برنامج تحليل الصور بسرعة لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها لبقع المكونات المتراكبة داخل كل فيلم حيوي. بعد ذلك ، قم بتدوير الصورة ثلاثية الأبعاد للحصول على عرض مثالي للأغشية الحيوية. ثم التقط لقطة لإعادة بناء الأغشية الحيوية وقم بتصدير اللقطة بتنسيق ملف صورة مناسب.

أخيرا ، قم بإجراء تحليل مرئي للتوزيع المتزامن للحمض النووي متعدد السكاريد الخارجي ومكونات البروتين داخل الأغشية الحيوية. في الصور المعاد بناؤها ، احسب المعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية مثل الحجم الحيوي ومتوسط سمك الأغشية الحيوية باستخدام برنامج ISA 3D في هذا الجدول ، يتم عرض قيم المتوسط والانحراف المعياري للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المحسوبة باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. يتم تسليط الضوء على قيم المتوسط والانحراف المعياري للمعلمات الهيكلية للأغشية الحيوية المعالجة بغسول الفم والتي اختلفت اختلافا كبيرا عن تلك الخاصة بالغشية الحيوية في المجموعة الضابطة في النماذج المختلطة الحمراء.

أظهرت التحليلات الإحصائية أن غسول الفم Biotene PBF أنتج هياكل غشاء حيوي اختلفت اختلافا كبيرا عن المجموعة الضابطة على كل من مركبات الراتنج ، في حين أن غسول الفم للعناية الكاملة من Listerine لم ينتج فروقا كبيرة في أي من مركب الراتنج مما يشير بوضوح إلى الاختلافات في مكونات الأغشية الحيوية الخلوية وخارج الخلية المتبقية بعد علاجي غسول الفم. يمكن تصور التوزيع المتزامن للسكريات الخارجية والأحماض النووية والبروتينات داخل الأغشية الحيوية من خلال عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج السرعة. في هذا الشكل ، تظهر إعادة بناء تمثيلية للأغشية الحيوية لمجموعة التحكم المزروعة على 0.4 اللون الأزرق الذي تم تعيينه لعديد السكاريد exo.

داخل الأغشية الحيوية S mutans ، تم تعيين اللون الأخضر للأحماض النووية واللون الأحمر للبروتينات. قد يشغل الماء أو مكونات الأغشية الحيوية الأخرى التي لم يتم تصنيفها بالفلورسنت. في هذا الشكل ، يتم عرض إعادة بناء تمثيلية للأغشية الحيوية لمجموعة التحكم المزروعة على ثلاثة مركبات راتنجية TPH مع الألوان التي تمثل نفس المكونات مثل الشكل السابق.

جلب هذا الإجراء تطبيقا في مجموعة متنوعة من التخصصات مثل العلوم الطبية وطب الأسنان والجيولوجيا والعلوم البحرية. نظرا لأنه يمكن استبدال العديد من الركائز والأغشية الحيوية بتلك المستخدمة هنا.