تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

نقدم نهجا جديدا لقياس توطين جسيمات متناهية الصغر في الأوعية الدموية للأورام xenografted الإنسان باستخدام الحيوية ، في الوقت الحقيقي التصوير intravital في نموذج جنين الطيور.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام باستخدام التصوير الحيوي الداخلي. يتم تحقيق ذلك عن طريق قصف وأزرعة أجنة الطيور أولا. الخطوة الثانية هي إنشاء أورام xenograft في غشاء chorio elan toic أو cam ، والسماح لها بالنمو لمدة أسبوع تقريبا.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في حقن الجسيمات النانوية عن طريق الوريد في الكاميرا وإجراء تصوير متحد البؤر داخل الحيوية في الوقت الفعلي لورم الطعم الغريب. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي استئصال الورم وتقسيمه. في النهاية ، يتم قياس امتصاص الجسيمات النانوية بواسطة الورم من الصور ويمكن إجراء تحليل الورم الثانوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنها تسمح بتوليد صور عالية الدقة لتقييم ديناميكيات تراكم الجسيمات النانوية في الأورام على المستوى المجهري. علاوة على ذلك ، باستخدام هذا النظام النموذجي ، يمكن لباحث واحد تحليل عدد كبير جدا من المجموعات التجريبية في غضون أسبوعين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول بسهولة إلى غشاء Cory Alloid لأجنة Shells للتلاعب الجسدي والتصوير غير الغازي.

مختبري على تطوير الجسيمات النانوية للتصوير الجزيئي المستهدف وتوصيل الأدوية في السرطان. قادنا بحثنا عن نموذج xenograft سريع وغير مكلف لإجراء تحليلات امتصاص مفصلة إلى جنين الدجاج الأصداف. نستخدم هنا التصوير داخل الحيوية عالي الدقة لتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الطعوم الغريبة للورم البشري في نموذج جنين الدجاج المعدل.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإعداد قائمة أجنة الدجاج المخصبة في اليوم الرابع. باستخدام الطريقة القياسية ، تأكد من تخصيب الأجنة وقابليتها للحياة عن طريق التحقق من ضربات القلب واحتضانها عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ على الأقل حتى الجنين. في اليوم التاسع ، تكون الأجنة جاهزة لتلقيح الخلايا السرطانية.

قم بتجميع حاقن صغير عن طريق توصيل إبرة قياس 18 بحقنة سعة مليلتر واحد بقطعة من خمسة إلى ست بوصات من أنابيب tigon. أدخل شطبة الإبرة بعناية في الأنبوب. يجب أن تمتد ما يقرب من أربع إلى خمس بوصات من الأنابيب من طرف الإبرة.

الآن ، ارسم تعليق الخلية السرطانية من خلال الأنبوب إلى المحقنة واقلبها. اضغط بحذر على جانب المحقنة واضغط على المكبس لإزالة أي فقاعات هواء. بعد ذلك ، أدخل إبرة زجاجية للحقن الدقيق في نهاية الأنبوب واضغط على المكبس حتى يصل تعليق الخلية إلى طرف الإبرة.

الآن ، تحت مجهر التشريح ، قم بحقن 10،000 إلى 100،000 خلية سرطانية ببطء وبعناية في الفضاء الخلالي داخل الكاميرا. يجب أن تشكل الخلايا بلعة مرئية داخل خلايا الكامة المودعة على سطح الكامة ، ويمكن إزالتها عن طريق التربيت برفق بمناديل كيم أو قضيب قطني. الآن ، أعد الأجنة إلى حاضنة عند 38 درجة مئوية مع رطوبة لا تقل عن 60٪.

سمح للورم بالنمو والأوعية الدموية لمدة تصل إلى سبعة أيام ، ويصل قطره إلى خمسة ملليمترات على الأقل قبل التصوير ، يجب تسمية الجسيمات النانوية بصبغة فلورية ، متوافقة مع المجهر داخل الحيوية وتخزينها عند أربع درجات مئوية في PBS حيث تكون مستقرة لمدة عام واحد على الأقل. ثم قم بتدوير الجسيمات النانوية لمدة دقيقة واحدة لتكسير أي مجاميع قبل سحبها إلى الحاقن الدقيق. باستخدام PBS الآن لتخفيف الجسيمات النانوية ، قم بإعداد تركيز عمل قدره ملليغرام واحد لكل مليلتر لحقن 50 ميكروغراما من الجسيمات النانوية في نهاية المطاف بحجم 50 ميكرولترا.

الآن تابع الحقن في اليوم 16 من التطور الجنيني. تأكد من أن الأورام معدة للأورام بما يكفي لاختيار أفضل الأجنة الحاملة للورم عن طريق الوريد. حقن دكسترين فلوري منخفض الوزن الجزيئي طيفيا ، متميزة عن الخلايا السرطانية والجسيمات النانوية.

ثم تخيل الدكسترين تحت المجهر الفلوري واختر الأجنة التي تحتوي على أكثر الأورام الوعائية. بمجرد اختيار الأجنة ، استخدم حاقن دقيق معد لإسقاط ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المحضرة. اقلب المحقنة.

اضغط بحذر على الجانب واضغط على المكبس لإزالة أي فقاعات هواء. الآن ، أدخل إبرة حقن مجهرية زجاجية مدببة طويلة في نهاية الأنبوب واضغط على المكبس حتى يصل محلول الجسيمات النانوية إلى طرف الإبرة. لن تخترق الإبرة الحادة الأديم الظاهر وستكسر إبرة شديدة الحادة والرفيعة عند إدخالها في الأنسجة.

بعد ذلك عن طريق الوريد ، قم بحقن ما بين 30 و 200 ميكرولتر من الجسيمات النانوية في أجنة بعيدة عن الجانب المطلوب ليتم تصورها مباشرة بعد حقن صورة الجسيمات النانوية. تبدأ الأورام كما هو موضح في القسم التالي بإعداد وحدة تصوير الأجنة. أولا ، ضع طبقة رقيقة من الشحوم المفرغة حول محيط منفذ التصوير على الجانب السفلي من الغطاء.

ثم ضع غطاء زجاجي مقاس 18 ملم على المنفذ. الآن قم بتحميل الجنين في الوحدة بحيث يكون زلة الغطاء أعلى من المنطقة المطلوبة للتصوير. قم بخفض غطاء الوحدة ببطء حتى يتلامس انزلاق الغطاء مع الجنين وقم بربط الغطاء في مكانه.

الآن املأ الطبق الذي يحتوي على الجنين في وحدة التصوير بماء 37 درجة مئوية. ستثبت هذه الوحدة الجنين في مكانه تحت المجهر متحد البؤر للقرص الدوار في المجهر الفلوري متحد البؤر للقرص الدوار. تأكد من أن الغرفة البيئية 37 درجة مئوية.

الآن ، ضع وحدة التصوير على المسرح بحيث تكون نافذة انزلاق الغطاء أسفل المجهر مباشرة. الموضوعية والمضي قدما في التصوير. الحصول على أكوام صور عالية الدقة للورم والأوعية الدموية المحيطة مباشرة بعد الحقن وعلى فترات كل ساعة.

بعد ذلك ، ستعكس الصور التغيرات الهيكلية التفصيلية التي تحدث في الأوعية الدموية للورم. يمكن تصوير الجنين بشكل مستمر لمدة تصل إلى 36 ساعة دون الحاجة إلى تغيير الحمام المائي. لتحديد امتصاص الجسيمات النانوية الفيروسية من الصور ، استخدم حزمة برامج مثل السرعة.

أولا ، حدد الورم وحدده عن السدى المحيط. يتم تسهيل الاختيار عن طريق تسمية الورم بدكسترين الفلورسنت. الآن احسب متوسط إشارة الفلورسنت من الجسيمات النانوية في الورم وفي المناطق التمثيلية للسدى المجاور.

بعد ذلك ، احسب نسبة متوسط الإشارة. تقوية اختيار الورم إلى الإشارة المتوسطة. تقوية اختيار اللحمة.

النسبة الأكبر من واحد إلى أن الجسيمات النانوية موضعية بشكل تفضيلي للورم. تم حقن خلايا سرطان القولون HT 29 لتشكيل بلعة يبلغ قطرها ملليمتر واحد تقريبا داخل كام اليوم التاسع. تم حقن أجنة الدجاج بعد سبعة أيام من الحضانة عن طريق الوريد مع دكسترين منخفض الوزن الجزيئي لتأكيد الأوعية الدموية للورم.

كشفت الإدارة الوريدية للجسيمات النانوية CPMV LOR 6 47 أو CPMV LOR 6 47 ، متبوعا بالتصوير متحد البؤر عالي الدقة في الوقت الفعلي ، أن كلا من جسيمات CPMV و CPMV النانوية المبتذلة قامت بسرعة بتسمية الأوعية الدموية بأكملها. في غضون 12 ساعة بعد الحقن ، كشف القياس الكمي لإشارة الفلورسنت في مناطق الورم مقابل السدى أن امتصاص CPMV في الورم كان أعلى بثلاث مرات تقريبا من CPMV. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير عالي الدقة داخل الحيوية لتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الطعوم الغريبة للورم في نموذج جنين الطيور من تحضير أجنة الطيور إلى تطعيم XOG للخلايا السرطانية ، والحقن في الوريد للجسيمات النانوية ، وتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام عن طريق التصوير متحد البؤر داخل الحيوية في الوقت الفعلي.