تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس كمية امتصاص الجسيمات النانوية داخل الأورام باستخدام التصوير الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة القشرة وزراعة أجنة الطيور. وتتمثل الخطوة الثانية في إنشاء أورام طعوم غريبة في الغشاء السلوي المشيمي (CAM)، وتركها لتنمو لمدة أسبوع واحد تقريباً.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في حقن الجسيمات النانوية وريدياً في الفأر وإجراء تصوير بؤري حيوي في الوقت الفعلي للورم الغريب. والخطوة النهائية من الإجراء هي استئصال الورم وتقطيعه إلى شرائح. وفي النهاية، يتم قياس كمية امتصاص الجسيمات النانوية من قبل الورم من خلال الصور، ويمكن إجراء تحليل ثانوي للورم.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تسمح بإنتاج صور عالية الدقة لتقييم ديناميكيات تراكم الجسيمات النانوية في الأورام على المستوى المجهري. علاوة على ذلك، وباستخدام هذا النظام النموذجي، يمكن لباحث واحد تحليل عدد كبير جداً من المجموعات التجريبية في غضون أسبوعين. بالإضافة إلى ذلك، يسهل الوصول إلى غشاء Cory Alloid في أجنّة Shells لإجراء المعالجة الفيزيائية والتصوير غير الباضع.

يركز مختبري على تطوير الجسيمات النانوية للتصوير الجزيئي المستهدف وإيصال الأدوية في مرض السرطان. وقد قادنا بحثنا عن نموذج طعم أجنبي (xenograft) سريع وغير مكلف لإجراء تحليلات مفصلة للامتصاص إلى استخدام جنين الدجاج في القشرة. نحن نستخدم هنا التصوير الحي عالي الدقة لتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام البشرية المزروعة كطعم أجنبي في نموذج معدل لجنين الدجاج في القشرة.

لهذا البروتوكول، قم بتحضير أجنة دجاج مخصبة في اليوم الرابع. باستخدام الطريقة القياسية، تأكد من أن الأجنة مخصبة وقابلة للحياة عن طريق التحقق من وجود نبضات القلب، وقم بحضنها عند 38 درجة مئوية مع رطوبة نسبية لا تقل عن 60% حتى اليوم التاسع من عمر الجنين، لتصبح الأجنة حينها جاهزة لتلقيح الخلايا الورمية.

قم بتجميع محقن دقيق عن طريق توصيل إبرة قياس 18 بشرنجة سعة 1 mL باستخدام قطعة من أنابيب tigon بطول تتراوح بين خمس إلى ست بوصات. أدخل شطب الإبرة بعناية في الأنبوب، مع مراعاة أن يمتد حوالي أربع إلى خمس بوصات من الأنبوب من طرف الإبرة.

الآن، اسحب معلق الخلايا الورمية عبر الأنابيب إلى المحقنة ثم اقلبها. انقر برفق على جانب المحقنة واضغط على المكبس لإزالة أي فقاعات هوائية. بعد ذلك، أدخل إبرة زجاجية للحقن المجهري في نهاية الأنابيب واضغط على المكبس حتى يصل معلق الخلايا إلى طرف الإبرة.

الآن، وباستخدام مجهر تشريحي، قم بحقن من 10,000 إلى 100,000 من الخلايا السرطانية ببطء وعناية في الحيز الخلالي داخل الغرفة (cam). يجب أن تشكل الخلايا كتلة مرئية داخل الغرفة، ويمكن إزالة الخلايا التي ترسبت على سطح الغرفة عن طريق التربيت الخفيف باستخدام منديل كيم وايب (kim wipe) أو مسحة قطنية. الآن، أعد الأجنة إلى الحاضنة عند درجة حرارة 38 °C مع رطوبة لا تقل عن 60%.

اترك الورم ينمو ويتكون فيه وعائية دموية لمدة تصل إلى سبعة أيام، حتى يصل قطره إلى خمسة مليمترات على الأقل قبل التصوير. يجب وسم الجسيمات النانوية بصبغة فلورية متوافقة مع المجهر الحي (intravital microscope)، وتُحفظ عند درجة حرارة 4 °C في محلول PBS حيث تظل مستقرة لمدة عام واحد على الأقل. بعد ذلك، قم بطرد الجسيمات النانوية مركزياً لمدة دقيقة واحدة لترسيب أي تجمعات قبل سحبها إلى المحقن الدقيق. الآن، وباستخدام محلول PBS لتخفيف الجسيمات النانوية، قم بتحضير تركيز عمل مقداره 1 mg/mL لحقن 50 µg من الجسيمات النانوية في حجم قدره 50 µL في النهاية.

باشر الآن بعمليات الحقن في اليوم 16 من التطور الجنيني. تحقق من أن الأورام مُوعاة بشكل كافٍ لاختيار أفضل الأجنة الحاملة للأورام عن طريق الحقن الوريدي. قم بحقن ديكسترين فلوري منخفض الوزن الجزيئي يكون متميزاً طيفياً عن الخلايا الورمية والجسيمات النانوية.

بعد ذلك، قم بفحص الديكسترين تحت مجهر فلوري واختر الأجنة التي تحتوي على الأورام الأكثر تروية وعائية. وبمجرد اختيار الأجنة، استخدم محقناً مجهرياً جاهزاً لحقن 200 µL على الأقل من الجسيمات النانوية المحضرة. ثم اقلب المحقنة.

انقر برفق على الجانب واضغط على المكبس لإزالة أي فقاعات هوائية. الآن، أدخل إبرة حقن مجهري زجاجية طويلة ومستدببة في نهاية الأنبوب، واضغط على المكبس حتى يصل محلول الجسيمات النانوية إلى طرف الإبرة. لن تخترق الإبرة غير المدببة الأديم الظاهر، بينما ستنكسر الإبرة الحادة والرقيقة للغاية عند إدخالها في النسيج.

بعد ذلك، قم بحقن ما بين 30 و200 µL من الجسيمات النانوية وريدياً في الأجنة في منطقة بعيدة عن الجانب المراد تصويره، ثم قم بتصوير الجنين مباشرة بعد حقن الجسيمات النانوية. أما بالنسبة للأورام كما هو موضح في القسم التالي، فابدأ بتجهيز وحدة تصوير الأجنة. أولاً، ضع طبقة رقيقة من شحم الفراغ حول محيط منفذ التصوير الموجود في الجانب السفلي من الغطاء.

بعد ذلك، قم بتركيب شريحة غطاء زجاجية بقطر 18 millimeter على الفوهة. الآن، ضع الجنين داخل الوحدة بحيث تكون شريحة الغطاء فوق المنطقة المراد تصويرها. اخفض غطاء الوحدة ببطء حتى تلامس شريحة الغطاء الجنين فحسب، ثم اربط الغطاء في مكانه.

الآن، قم بملء الطبق الذي يحتوي على الجنين في وحدة التصوير بماء بدرجة حرارة 37 °C. ستعمل هذه الوحدة على تثبيت الجنين في مكانه تحت المجهر البؤري ذو القرص الدوار في مجهر الفلورة البؤري ذو القرص الدوار. تحقق من أن الغرفة البيئية عند درجة حرارة 37 °C.

الآن، قم بوضع وحدة التصوير على المنصة بحيث تكون نافذة غطاء الشريحة مباشرة أسفل عدسة المجهر الشيئية، ثم ابدأ في عملية التصوير. قم بالتقاط مجموعات من الصور عالية الدقة للورم والأوعية الدموية المحيطة به مباشرة بعد الحقن وبفواصل زمنية كل ساعة.

بعد ذلك، ستعكس الصور التغيرات الهيكلية التفصيلية التي تطرأ على الأوعية الدموية للورم. يمكن تصوير الجنين بشكل مستمر لمدة تصل إلى 36 ساعة دون الحاجة إلى تغيير الحمام المائي. ولتحديد كمية امتصاص الجسيمات النانوية الفيروسية من الصور، استخدم حزمة برمجيات مثل velocity.

أولاً، حدد الورم وقم برسم حدوده لتمييزه عن السدى المحيطة به. يتم تسهيل عملية التحديد عن طريق وسم الورم بالدكسترين الفلوري. الآن، احسب متوسط الإشارة الفلورية للجسيمات النانوية في الورم وفي مناطق ممثلة من السدى المجاورة.

بعد ذلك، احسب نسبة الإشارة المتوسطة. قم بتعزيز تحديد الورم بالنسبة للإشارة المتوسطة. قم بتعزيز تحديد السداة.

تشير النسبة التي تزيد عن واحد إلى أن الجسيمات النانوية تتركز بشكل تفضيلي في الورم. تم حقن خلايا سرطان القولون HT 29 لتكوين كتلة بقطر يبلغ حوالي واحد مليمتر تقريبًا داخل غشاء السقاء في اليوم التاسع. وبعد سبعة أيام من الحضن، تم حقن أجنة الدجاج وريدياً بدكسترين منخفض الوزن الجزيئي للتأكد من تكوّن الأوعية الدموية في الورم.

كشف الحقن الوريدي لجسيمات CPMV LOR 6 47 النانوية أو جسيمات CPMV LOR 6 47 النانوية المبيجلية (pegylated)، متبوعاً بالتصوير المجهري البؤري عالي الدقة في الوقت الفعلي، أن كلاً من جسيمات CPMV وجسيمات CPMV المبيجلية النانوية قد قامت بتمييز الشبكة الوعائية بأكملها بسرعة. وخلال 12 ساعة بعد الحقن، كشف قياس الإشارة الفلورية في مناطق الورم مقابل مناطق السدى أن امتصاص جسيمات CPMV المبيجلية في الورم كان أعلى بنحو ثلاث مرات من امتصاص جسيمات CPMV. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الحي عالي الدقة لتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الطعوم الورمية الغريبة في نموذج جنين الطيور، بدءاً من تحضير أجنة الطيور وصولاً إلى زراعة الخلايا الورمية الغريبة، والحقن الوريدي للجسيمات النانوية، وتقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام عن طريق التصوير المجهري البؤري الحي في الوقت الفعلي.