ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل ناقضات العظم عن نخاع عظم الفأر بأعداد كبيرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد العظام الأولى من الفئران التي تم القتل رحيم. بعد ذلك ، يتم تحرير الخلايا من نخاع العظم باستخدام الهاون والمدقة لسحق العظام في الحقائق

ثم يتم وضع محلول نخاع العظم في طبقات على وسط فصل الخلايا المتدرجة للكثافة ويتم فصل الخلايا المتدرجة الكثافة. أخيرا ، يتم شفط الطبقة التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية وتوضع الخلايا في وسط تحريض نخاع العظم الميكروفاج. في النهاية ، يتم استخدام تلطيخ المصيدة لإظهار وجود عدد كبير من ناقضات العظم.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى الأمراض المرتبطة بتغير وظيفة ناقضات العظم ، والتي يمكن أن تتراوح شدتها من مرض حديثي الولادة المميت بسبب الفشل في تكوين النخاع لتكون الدم إلى مواجهة أمراض أكثر شيوعا مثل هشاشة العظام لأنها تنتج طريقة موثوقة لعزل عدد كبير من ناقضات العظم من نخاع عظم الفأر. للبدء ، أحضر 10 ملليلتر من فصل الخلايا المتدرجة الكثافة المتوفرة تجاريا ، متوسطة إلى درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع كمية 50 مليلتر من المخزن المؤقت للفاكس في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها مع وسط فصل الخلايا المتدرجة الكثافة.

بعد إعداد وسائط إضافية والقتل الرحيم لستة ماوس أسود C 57 ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع الماوس على لوحة تشريح واستخدم 70٪ من الإيثانول. لرشها ، احصد فيرا الظنبوب هممهمة العين والعمود الفقري. ثم ضع العظام في عازلة الحقائق على الجليد.

بعد ذلك ، باستخدام المناديل الورقية النظيفة ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الرخوة من العظام. ضع العظام في هاون ومدقة مع ثلاثة ملليلتر من الحقائق عازلة وسحقها برفق. ثم استنشق السائل الملطخ بالدم وقم بتمريره عبر مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

أضف خمسة ملليلتر إضافية من المخزن المؤقت للتأثيرات إلى العظم المكسر وسحقها أكثر قبل نقل السائل عبر المصفاة إلى أنبوب 50 مل. استمر في هذه العملية حتى يتوقف السائل عن البقعة الحمراء قبل تكوير نخاع العظم عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. لإجراء فصل التدرج ، قم بشفط المواد الطافية من حبيبات الخلية واستخدم 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس لإعادة النسخ.

قم بتعليق الحبيبات ، وإمالة الأنبوب المخروطي لوسط فصل الخلايا المتدرجة بكثافة درجة حرارة الغرفة إلى حوالي 30 درجة ، واستخدم ماصة كهربائية مع طرف الماصة على السطح العلوي الداخلي للأنبوب. ضع طبقة ببطء من محلول نخاع العظم على الوسط باستخدام جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة الغرفة دون تسارع أو تباطؤ. قم بتدوير التدرج عند 200 جم لمدة 15 دقيقة.

ثم استنشق الطبقة الوسطى الغائمة ، التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد. أضف 20 مل من مخزن الفاكس المثلج لغسل الخلايا. ثم استخدم ملليلترا واحدا من وسط تحفيز نخاع العظم الميكروفاج لإعادة تعليق حبيبات الخلية النهائية بعد عد الخلايا.

ضع ملليلترين من وسط تحفيز الميكروفاج في كل بئر من صفيحة 24 بئر. ثم أضف 200،000 خلية إلى كل بئر ، وهي كثافة خلوية تضمن زراعة ناقضات العظم في المختبر الكافية. حرك الطبق برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية دون تغيير الوسط لمدة ثلاثة أيام.

بعد اليوم الثالث ، قم بتغيير وسط تحريض ناقضة العظم في نخاع العظم وابدأ في تغييره يوميا لمدة خمسة إلى سبعة أيام. عند هذه النقطة يجب أن تكون ناقضات العظم الكبيرة متعددة النوى مرئية. راجع بروتوكول النص للتلوين ومقايسة الارتشاف كما هو موضح هنا.

يمكن تأكيد وجود عدد كبير من ناقضات العظم باستخدام مقايسة مقاومة الطرطرات. يتم تصور ناقضات العظم التي تلطخ الفوسفوتات على أنها خلايا أرجوانية كبيرة ذات نوى متعددة باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. من الشائع عزل ناقضات العظم بما يصل إلى 30 نواة لكل خلية.

يعتبر استخدام سطح معدني الطريقة القياسية الذهبية لتقييم نشاط ارتشاف ناقضات العظم في المختبر. في هذا الشكل ، يوضح الفحص المجهري للحقل الساطع عند تكبير 10 × نسبة مئوية من السطح المعدني أو حفر الامتصاص التي تتشكل كما هو موضح باللون الأسود ، مما يسمح بتحديد قدرة ارتشاف العظم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل عدد كبير من ناقضات العظم بشكل موثوق من نخاع عظم الفأر.