ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم
November 6th, 2014
الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في المختبر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل ناقضات العظم عن نخاع عظم الفأر بأعداد كبيرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد العظام الأولى من الفئران التي تم القتل رحيم. بعد ذلك ، يتم تحرير الخلايا من نخاع العظم باستخدام الهاون والمدقة لسحق العظام في الحقائق
.ثم يتم وضع محلول نخاع العظم في طبقات على وسط فصل الخلايا المتدرجة للكثافة ويتم فصل الخلايا المتدرجة الكثافة. أخيرا ، يتم شفط الطبقة التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية وتوضع الخلايا في وسط تحريض نخاع العظم الميكروفاج. في النهاية ، يتم استخدام تلطيخ المصيدة لإظهار وجود عدد كبير من ناقضات العظم.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى الأمراض المرتبطة بتغير وظيفة ناقضات العظم ، والتي يمكن أن تتراوح شدتها من مرض حديثي الولادة المميت بسبب الفشل في تكوين النخاع لتكون الدم إلى مواجهة أمراض أكثر شيوعا مثل هشاشة العظام لأنها تنتج طريقة موثوقة لعزل عدد كبير من ناقضات العظم من نخاع عظم الفأر. للبدء ، أحضر 10 ملليلتر من فصل الخلايا المتدرجة الكثافة المتوفرة تجاريا ، متوسطة إلى درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع كمية 50 مليلتر من المخزن المؤقت للفاكس في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها مع وسط فصل الخلايا المتدرجة الكثافة.
بعد إعداد وسائط إضافية والقتل الرحيم لستة ماوس أسود C 57 ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع الماوس على لوحة تشريح واستخدم 70٪ من الإيثانول. لرشها ، احصد فيرا الظنبوب هممهمة العين والعمود الفقري. ثم ضع العظام في عازلة الحقائق على الجليد.
بعد ذلك ، باستخدام المناديل الورقية النظيفة ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الرخوة من العظام. ضع العظام في هاون ومدقة مع ثلاثة ملليلتر من الحقائق عازلة وسحقها برفق. ثم استنشق السائل الملطخ بالدم وقم بتمريره عبر مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
أضف خمسة ملليلتر إضافية من المخزن المؤقت للتأثيرات إلى العظم المكسر وسحقها أكثر قبل نقل السائل عبر المصفاة إلى أنبوب 50 مل. استمر في هذه العملية حتى يتوقف السائل عن البقعة الحمراء قبل تكوير نخاع العظم عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. لإجراء فصل التدرج ، قم بشفط المواد الطافية من حبيبات الخلية واستخدم 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس لإعادة النسخ.
قم بتعليق الحبيبات ، وإمالة الأنبوب المخروطي لوسط فصل الخلايا المتدرجة بكثافة درجة حرارة الغرفة إلى حوالي 30 درجة ، واستخدم ماصة كهربائية مع طرف الماصة على السطح العلوي الداخلي للأنبوب. ضع طبقة ببطء من محلول نخاع العظم على الوسط باستخدام جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة الغرفة دون تسارع أو تباطؤ. قم بتدوير التدرج عند 200 جم لمدة 15 دقيقة.
ثم استنشق الطبقة الوسطى الغائمة ، التي تحتوي على الخلايا ذات الأهمية ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد. أضف 20 مل من مخزن الفاكس المثلج لغسل الخلايا. ثم استخدم ملليلترا واحدا من وسط تحفيز نخاع العظم الميكروفاج لإعادة تعليق حبيبات الخلية النهائية بعد عد الخلايا.
ضع ملليلترين من وسط تحفيز الميكروفاج في كل بئر من صفيحة 24 بئر. ثم أضف 200،000 خلية إلى كل بئر ، وهي كثافة خلوية تضمن زراعة ناقضات العظم في المختبر الكافية. حرك الطبق برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية دون تغيير الوسط لمدة ثلاثة أيام.
بعد اليوم الثالث ، قم بتغيير وسط تحريض ناقضة العظم في نخاع العظم وابدأ في تغييره يوميا لمدة خمسة إلى سبعة أيام. عند هذه النقطة يجب أن تكون ناقضات العظم الكبيرة متعددة النوى مرئية. راجع بروتوكول النص للتلوين ومقايسة الارتشاف كما هو موضح هنا.
يمكن تأكيد وجود عدد كبير من ناقضات العظم باستخدام مقايسة مقاومة الطرطرات. يتم تصور ناقضات العظم التي تلطخ الفوسفوتات على أنها خلايا أرجوانية كبيرة ذات نوى متعددة باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. من الشائع عزل ناقضات العظم بما يصل إلى 30 نواة لكل خلية.
يعتبر استخدام سطح معدني الطريقة القياسية الذهبية لتقييم نشاط ارتشاف ناقضات العظم في المختبر. في هذا الشكل ، يوضح الفحص المجهري للحقل الساطع عند تكبير 10 × نسبة مئوية من السطح المعدني أو حفر الامتصاص التي تتشكل كما هو موضح باللون الأسود ، مما يسمح بتحديد قدرة ارتشاف العظم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل عدد كبير من ناقضات العظم بشكل موثوق من نخاع عظم الفأر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لفصل الخلايا العظمية عن نخاع عظم الفئران بكميات كبيرة. يتضمن العملية جمع العظام، وتحرير الخلايا، واستخدام الفصل بالتدرج الكثالي لفصل الخلايا العظمية لمزيد من الدراسة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا العظام
- تقنيات عزل الخلايا
- تحديد كمية نشاط الخلايا العظمية
الخلفية
- الخلايا العظمية ضرورية لامتصاص العظام.
- فهم بيولوجيا الخلايا العظمية ضروري للحصول على رؤى حول أمراض العظام.
- تقنيات العزل قد طورت دراسة هذه الخلايا.
- هذا البروتوكول يهدف إلى تعزيز إنتاج الخلايا العظمية للبحث.
هدف الدراسة
- لعزل الخلايا العظمية من نخاع عظم الفئران.
- لزراعة الخلايا العظمية في المختبر للتحليل التجريبي.
- لتحديد كمية نشاط الخلايا العظمية باستخدام طرق التلوين المحددة.
الطرق المستخدمة
- جمع العظام من الفئران المقتولة.
- سحق العظام في مخزن الحقائق لتحرير الخلايا.
- تنفيذ الفصل الخلوي بالتدرج الكثالي.
- استخدام وسط تحريض المكروفات لنخاع العظام لزراعة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للخلايا العظمية بأعداد كبيرة.
- الزراعة الفعالة للخلايا العظمية في المختبر.
- إثبات وجود الخلايا العظمية من خلال تلوين المصائد.
- تحقيق تحديد كمية نشاط الخلايا العظمية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لعزل الخلايا العظمية.
- يسهل المزيد من البحث في بيولوجيا الخلايا العظمية.
- تطبيقات محتملة في دراسة الأمراض المتعلقة بالعظام.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Reliable in vitro derivation of osteoclasts from mouse bone marrow enables high-confidence interrogation of bone resorption mechanisms and disease-relevant cellular phenotypes. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in early-stage bone disease drug discovery. The method supports portfolio decisions by providing scalable access to functional osteoclasts for quantitative assessment of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of bone resorption hypotheses in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating osteoclast-specific effects.
- Facilitates functional target validation for bone disease pathways.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Generates validated osteoclast populations for downstream resorption assays.
- Enables standardization of quantitative TRAP staining and resorption pit assays.
- Supports reproducible, scalable workflows for compound screening.
- Allows for robust evaluation of osteoclast-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone remodeling endpoints.
- Provides continuity from cellular mechanism to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted therapeutic candidates.
- Supports translational biomarker development for bone resorption activity.
Pipeline & Workflow Integration
This osteoclast derivation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational studies in bone biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast-mediated bone resorption mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of multinucleation, TRAP positivity, and resorptive capacity for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo bone remodeling and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for osteoclast isolation across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bone resorption target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible osteoclast cultures at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for bone disease programs by reducing biological ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of osteoclast-targeted therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and bone marrow handling.
- Needs access to density gradient separation and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of TRAP staining and resorption assays.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Dependent on careful quantification and validation of osteoclast identity and function.
