ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي KCNJ10 (Kir4.1)
September 26th, 2015
مثيلة الحمض النووي قادرة على الحفاظ على مستويات مستقرة من التعبير الجيني بالإضافة إلى السماح بتغييرات ديناميكية في التعبير الجيني استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات. نحن نفصل التقنيات التي تسمح بدراسة التغيرات الخاصة بالجينات في مثيلة الحمض النووي وتأثير هذه التغييرات على التعبير الجيني.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم حالة مثيلة الحمض النووي ل KCNJ 10 في مجموعة غنية من الخلايا النجمية وربط تغيرات مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط اختياري للنسخ. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل مجموعة غنية من الخلايا النجمية القشرية أولا من دماغ القوارض بأكملها عن طريق فرز الحقائق التالية يتم عزل الحمض النووي من السكان المخصبين للخلايا النجمية. ثم يتم تقييم حالة مثيلة الحمض النووي ل KC J 10 باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة أو MS. HRMA.
أخيرا ، يتم فرط ميثيل KC J 10 ويتم استخدام مقايسة اللوسيفر لربط التغيرات في مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط النسخ. في النهاية ، MS. يتم استخدام HRMA ومقايسة لوسيفيراز لقياس حالة مثيلة الحمض النووي ل KCNJ 10 وربط التغييرات في مثيلة المحفز ونشاط النسخ للجين الذي سينظر إلى الإجراء. زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري ، تم التعامل مع جميع وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة ، ووافقت لجنة رعاية واستخدامه في جامعة ألاباما في برمنغهام على استخدام.
تم إعداد جميع المخازن المؤقتة والكواشف وفقا لبروتوكول النص. بعد تشريح القشرة من رأس قتل رحيم ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع أو إحداث ثقب في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للسماح بإدخال الأنابيب في الأنبوب. ثم أضف محلول البابين إلى الأنبوب.
ضع القشرة المقطعة في طبق استزراع 10 ملم يحتوي على وسط تفكك متوازن إلى 95٪ O2 إلى 5٪ CO2 ، واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لفرم الأنسجة إلى قطع واحدة في مليمتر مربع. باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ، ينقل الرجال الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول البيبان. اترك الأنسجة تستقر في قاع ماصة النقل قبل تفريغها.
لتقليل كمية وسط التفكك المنقولة دون فقاعات محلول البيبان ، قم بتطبيق تدفق ثابت من 95٪ O2 إلى 5٪ CO2 عبر تبادل الغازات السطحية أثناء الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم ماصة نقل 10 مل لتنظيف الأنسجة ببطء 10 مرات بالطرد المركزي لتعليق الخلية الغائمة عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بموازنة محلول مثبط الألبومين في الحمض النووي عن طريق تبادل الغازات السطحية وإعادة تعليق الخلايا المحببة في ثلاثة ملليلتر من المحلول.
ثم قم بإعداد تدرج كثافة متقطع تجاري باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتدوير تدرج الكثافة المتقطع عند 70 جم لمدة ست دقائق. ثم اعزل الخلايا المنفصلة عن قاع الأنبوب باستخدام ماصة لشفط الوسائط.
استخدم ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من DPBS مع 0.02٪ ألبومين مصل بقري ومليغرام واحد لكل مليلتر من الحمض النووي أو الوسائط المفضلة. لإعادة ، قم بتعليق الخلايا المنفصلة. قم بتمرير الخلايا عبر مرشح 40 ميكروغرام قبل إجراء فرز الحقائق واستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول النص.
بعد تصميم بادئات مقابل تسلسل الحمض النووي المحول ثنائي الكبريتيت وتضخيم الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص بواسطة الكبريتيت ، قم بتحويل 500 إلى 1000 نانوجرام من الحمض النووي لكل عينة ومعايير الحمض النووي الميثيلية التي تتراوح من صفر إلى 100٪ من نفس الأنواع الحيوانية باستخدام بوليميراز الحمض النووي المفضل وخمسة بادئات ميكرومولار. قم بإعداد تفاعلات 20 ميكرولتر لتضخيم MS HRM. وفقا لهذا الجدول ، قم بتشغيل جميع العينات بما في ذلك الفاكس والحمض النووي ومعايير الميثيل في ثلاث نسخ اعتمادا على مجموعة برامج التحليل ، ومعلمات البدء والإيقاف قبل وبعد حول انتقالات منحنى الذوبان.
اضبط معلمات توقف الذوبان والبدء والذوبان المبكر. إذن، الفرق بين الاثنين يساوي 0.2 إلى 0.5 درجة سلزية. قم بتعيين ما بعد الذوبان والبدء والتوقف بالمثل واستخرج بيانات فرق درجة حرارة الذروة لكل عينة باستخدام معايير الميثيل المئوية والاختلافات في درجات حرارة الذروة المقابلة لها.
إنشاء معادلة انحدار خطي. استخدم معادلة الانحدار الخطي هذه لتقدير حالة مثيلة العينات غير المعروفة بعد تحديد جزر CPG ذات الأهمية وتضخيم واستنساخ جزيرة CPG Luke two البلازميد وفقا لبروتوكول النص. استخدم برنامج القطع المفضل للتحقق من مواقع ملخص التقييد لتجنب التخفيضات المزدوجة وخطية 30 ميكروغراما من البلازميد بمجرد هضم العينة بالإنزيمات المناسبة.
تعطيلالإنزيمات الحرارة عند درجة الحرارة والمدة المناسبة في تفاعلات 50 ميكرولتر. استخدم خمس وحدات من ميثيلات CPG للميثيليات. 700 ميكروغرام من البلازميدات الخطية عند 30 درجة مئوية لمدة 13 إلى 19 ساعة.
بعد تنظيف الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء ملخص تقييد HPA على عينة ميكروغرام واحدة من الحمض النووي الميثيلي عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد تنظيف الحمض النووي ، قم بتشغيل العينات على 1٪ agros ، هلام الحمض النووي عند 100 فولت لمدة 45 دقيقة للتصور. الموضوع التالي ، البلازميدات الميثيلية وغير الميثيلة لمضاعفة الهضم مع إنزيمات التقييد المناسبة بين عشية وضحاها لإطلاق شظايا لوقا اثنين من المتجهات وجزيرة CPG بطول كامل.
الحرارة تعطيل الإنزيمات بعد الهضم. قم بتشغيل العينات المهضومة المزدوجة على هلام 1٪ DNA agros عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة لفصل المتجه وإدخاله ، ثم أثناء ارتداء الحماية من الأشعة فوق البنفسجية ، ضع الجل على ضوء أسود وبشفرات جراحية نظيفة ، قم باستئصال الإدخالات الميثيلية وغير الميثيلية بعد استخراج الحمض النووي وفقا لبروتوكول النص ، استخدم T أربعة DNA Ligase ونسبة واحد إلى أربعة من المتجه لإدخاله لإدراج الإدخالات الميثيلية وغير الميثيلية إلى ناقل غير ميثيلي. احتضن عند سالب 20 درجة مئوية أو على الجليد طوال الليل بعد الربط.
قم بتنظيف الحمض النووي والتحقق من إعادة الربط عن طريق تشغيل عينات على هلام DNA aros بنسبة 1٪ وتقييم تركيز خلايا البلازميد المعاد ربطها CD 54 على صفيحة 12 بئرا عند 140،000 خلية لكل بئر. بعد 24 ساعة. استخدم كاشف تعداء تجاري لنقل الخلايا بتركيزات متساوية إما من حلقة CPG غير الميثيلية ، أو اثنين من البلازميد بالإضافة إلى RAN أو الفانيليا أو ناقل حديد آخر أو ميثليته c pg Luke اثنين من البلازميد بالإضافة إلى ELLA أو ناقل لوسيفر التحكم الآخر اسمح للخلايا بالتعدين لمدة 24 ساعة قبل إجراء فحص اللوسيفر.
وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، استخدم مقياس الإضاءة لقراءة كل بئر في ثلاث نسخ. احسب نسبة نشاط اليراع لوسيفر إلى تشغيل الفانيليا أو أي عنصر تحكم آخر. نشاط لوسيفر.
تطبيع نشاط لوسيفيراز التحكم في اليراع الميثيلي إلى نشاط لوسيفيراز التحكم في اليراع غير الميثيلي عن طريق قسمة النشاط الميثيلي على نشاط لوك الميثيلي. كما هو موضح هنا ، تم الحصول على مجموعة غنية من الخلايا النجمية عن طريق الفرز بالفاكس للحيوانات المعدلة وراثيا بيتا 100. تم استهداف مجموعة مسورة بناء على التشتت الأمامي والجانبي ، وتم تحديد مجموعة الخلايا الحية باستخدام مؤشر الخلايا الميتة البروميد والبوابة الموضحة هنا هي صور تمثيلية للخلايا النجمية الإيجابية EGFP بعد التفكك ، ولكن قبل الفرز وكذلك بعد الفرز ، يظهر هذا الشكل مجموعة خلايا إيجابية معزولة ل EGFP أظهرت زيادة بمقدار 40 ضعفا في mRNA لعلامة الخلايا النجمية المحددة.
أ LDH واحد L واحد. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من التعبير المشترك عن S 100 beta و NG اثنين من OPCs الإيجابية والخلايا النجمية ، فقد لوحظ انخفاض أربعة أضعاف في NG اثنين من mRNA ، وقد لوحظ علامة لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن تشير إلى عزل مجموعة الخلايا النجمية المخصبة. يسرد هذا الجدول إجمالي الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، المعزول عن أعمار وعدد مختلف من ، ويتم إدراجه كمرجع للعائد المتوقع للجزيئات الجزيئية بعد الحقائق.
أخيرا ، تم استخدام مقايسة اللوسيفر المزدوجة لتقييم نشاط النسخ للمناطق المفرطة الميثيل للجين محل الاهتمام بعد نقل الإدخال الميثيلي إلى ناقل غير ميثيلي. تم استخدام HPA two ، الذي يهضم فقط الحمض النووي غير الميثيلي للتحقق من حالة مثيلة البلازميد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعة من الخلايا النجمية المثرية باستخدام الحقائق بالإضافة إلى كيفية قياس مثيلة الحمض النووي للجين وربط التغييرات في مثيلة الحمض النووي للمحفز بنشاط النسخ باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة ومقايسة لوسيفيراز على التوالي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تبحث هذه الدراسة في حالة مثيلة الحمض النووي لجين KCNJ10 في الخلايا النجمية وارتباطه بالنشاط النسخ. يتم استخدام تقنيات مثل تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة واختبارات اللوسفيراز لتقييم هذه التغيرات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم التخلق
- تعبير الجينات
الخلفية
- يلعب مثيلة الحمض النووي دورًا حاسمًا في تنظيم تعبير الجينات.
- يمكن أن تؤثر التغيرات في مثيلة الحمض النووي على استجابات الخلايا لمختلف المحفزات.
- الخلايا النجمية هي لاعبين رئيسيين في الجهاز العصبي المركزي ويمكن أن تتأثر تعبيرها الجيني بالتعديلات التخلقية.
- KCNJ10 هو جين مهم نظرًا لدوره في نقل الأيونات والوظيفة العصبية.
هدف الدراسة
- لتقييم حالة مثيلة الحمض النووي لمروج KCNJ10 في الخلايا النجمية.
- لربط التغيرات في مثيلة الحمض النووي بالنشاط النسخ لـ KCNJ10.
- لاستخدام تجارب محددة لقياس هذه التغيرات بشكل فعال.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا النجمية القشرية من دماغ القوارض باستخدام فرز FACS.
- عزلة الحمض النووي من مجموعة غنية بالخلايا النجمية.
- تقييم حالة مثيلة الحمض النووي باستخدام تحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة (MS.HRMA).
- ربط تغيرات مثيلة الحمض النووي بالنشاط النسخ باستخدام اختبارات اللوسفيراز.
النتائج الرئيسية
- التعرف على فرط المثيلة في منطقة مروج KCNJ10.
- إظهار وجود ارتباط بين حالة المثيلة والنشاط النسخ.
- التحقق من صحة الطرق المستخدمة لتقييم مثيلة الحمض النووي وتعبير الجينات.
- رؤى حول دور مثيلة الحمض النووي في تنظيم تعبير KCNJ10 في الخلايا النجمية.
الاستنتاجات
- مثيلة الحمض النووي هي منظم مهم لتعبير KCNJ10 في الخلايا النجمية.
- MS.HRMA واختبارات اللوسفيراز هي أدوات فعالة لدراسة التغيرات التخلقية المحددة للجينات.
- فهم هذه الآليات يمكن أن يوفر رؤى حول وظيفة الخلايا النجمية وتنظيم الجينات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding gene-specific DNA methylation dynamics in astrocytes provides mechanistic de-risking for targets like KCNJ10 in neuropsychiatric and neurodegenerative disease programs. Correlating promoter methylation with transcriptional activity enables predictive confidence in target validation and supports early-stage hypothesis interrogation. This approach enhances translational biomarker alignment by linking epigenetic states to functional outputs in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether DNA methylation changes at the KCNJ10 promoter are sufficient to alter transcriptional activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct assessment of epigenetic regulation in a disease-relevant cell type.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing correlative and causal links between epigenetic marks and gene expression in astrocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated astrocytic models for downstream epigenetic screening using MS-HRMA and luciferase readouts.
- Operational Value: Standardizes quantitative methylation and transcriptional measurements for reproducible compound screening.
- Scalability: Enables platform reuse across CNS targets by combining FACS enrichment with locus-specific methylation and expression analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by examining KCNJ10 methylation in astrocytes, a key cell type in CNS disorders.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by linking epigenetic modulation to functional outcomes.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating mechanistic de-risking of epigenetic targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates FACS-enriched astrocytes with locus-specific methylation and transcriptional analysis, supporting workflows from target validation to preclinical modeling in CNS drug discovery.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by correlating KCNJ10 promoter methylation with astrocytic gene expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible outputs from MS-HRMA and luciferase assays.
- Analytics: Provides methylation percentage and transcriptional activity readouts that enable condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant astrocytic models to assess epigenetic regulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying gene-specific epigenetic mechanisms across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of methylation-expression correlation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenetic target validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in FACS sorting, epigenetic analysis, and luciferase reporter assays.
- Instrumentation needs include flow cytometer, qPCR or melt analysis platform, and luminometer.
- Cross-team standardization requires alignment between molecular biology, epigenetics, and assay development groups.
- Adaptation considerations include model system validity and promoter-specific assay design for other targets.
- Practical limitations include tissue yield from FACS and sensitivity of methylation detection in heterogeneous samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
RNA and DNA Isolation from an Enriched Astrocytic Population using FACS
4:03
Assessing DNA Methylation Status of a Gene Using Methylation-sensitive High Resolution Melt Analysis
5:26
Assessing Hyper-methylated Promoter Activity using a Luciferase Assay
8:50
Results: DNA Methylation Analysis of KCNJ10 in Astrocytes
10:42
Conclusion
