ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم حالة مثيلة DNA لـ KCNJ 10 في مجموعة مثرية من الخلايا النجمية، وربط تغيرات مثيلة DNA في المحفز بالنشاط النسخي الاختياري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل مجموعة مثرية من الخلايا النجمية القشرية من دماغ قارض كامل عبر فرز FACS، ثم يتم عزل DNA من المجموعة المثرية من الخلايا النجمية. بعد ذلك، يتم تقييم حالة مثيلة DNA لـ KC J 10 باستخدام تحليل الصهر عالي الدقة الحساس للمثيلة أو MS.HRMA.

وأخيرًا، يكون محفز KCNJ 10 مفرط الميثيل، ويُستخدم مقايسة اللوسيفيريز لربط التغيرات في ميثيلية DNA للمحفز بالنشاط النسخي. وفي النهاية، تُستخدم تقنية MS-HRMA ومقايسة اللوسيفيريز لقياس حالة ميثيلية DNA لـ KCNJ 10 وربط التغييرات في ميثيلية المحفز بالنشاط النسخي للجين، حيث سيتم عرض الإجراء التوضيحي. قام زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري بإجراء ذلك، وقد تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقًا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة، كما وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ألاباما في برمنغهام على استخدام الحيوانات.

تم تحضير جميع المحاليل المنظمة والكواشف وفقاً لبروتوكول النص. بعد استئصال القشور المخية من رأس حيوان تم قتله رحيمًا، وفقاً لبروتوكول النص، قم بعمل ثقب في الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter باستخدام المقص أو أداة الدريمل للسماح بتمرير الأنابيب إلى داخل الأنبوب. ثم أضف محلول البابين إلى الأنبوب.

ضع القشور المخلقة في طبق زراعة بحجم 10 مليمتر يحتوي على وسط تفكيك متوازن بنسبة 95%O2 إلى 5%CO2، واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لتقطيع النسيج إلى قطع مربعة بحجم 1 مليمتر مربع لكل منها. وباستخدام ماصة سعة 10 مليمتر، انقل النسيج إلى أنبوب سعة 50 مليمتر يحتوي على محلول الـ pepane. اترك النسيج يستقر في قاع ماصة النقل قبل تفريغه.

لتقليل كمية وسط التفكيك المنقولة دون إحداث فقاعات في محلول الببان، يتم تطبيق تدفق مستمر من 95%O2 إلى 5%CO2 عبر التبادل الغازي السطحي أثناء التحضين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد التحضين، استخدم ماصة نقل سعة 10 مل لتقليب النسيج ببطء 10 مرات، ثم قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا العكر عند 300 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بموازنة محلول مثبط الألبومين الخاص بالـ DNA عبر التبادل الغازي السطحى، ثم أعد تعليق الخلايا المترسبة في ثلاثة مل من المحلول.

بعد ذلك، قم بتحضير تدرج كثافة غير مستمر تجاري وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء طرد مركزي لتدرج الكثافة غير المستمر عند 70 G لمدة ست دقائق. ثم اعزل الخلايا المنفصلة من قاع الأنبوب باستخدام الماصة لسحب الوسط.

استخدم من اثنين إلى ثلاثة مللي لتر من DPBS المحتوي على 0.02% bovine serum albumin ومليجرام واحد لكل مللي لتر من DNA أو الوسط المفضل. لإعادة الاستخدام، قم بتعليق الخلايا المفككة. مرر الخلايا عبر مرشح 40 ميكرومتر قبل إجراء الفرز الخلوي واستخلاص DNA أو RNA وفقاً للبروتوكول المذكور.

بعد تصميم البادئات ضد تسلسل DNA محول بالبايسلفيت وتضخيم الـ DNA وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم تحويل 500 إلى 1000 نانوغرام من الـ DNA لكل عينة ومعايير DNA الميثيلية التي تتراوح من 0% إلى 100% من نفس الفصيلة الحيوانية باستخدام DNA polymerase مفضل وبادئات بتركيز 5 ميكرومولار. يتم إعداد تفاعلات بحجم 20 ميكرولتر لتضخيم Ms HRM. ووفقاً لهذا الجدول، يتم تشغيل جميع العينات بما في ذلك الـ DNA الفراغي والمعايير الميثيلية في ثلاث مكررات، وبناءً على برنامج التحليل، يتم ضبط معاملات البدء والتوقف (pre and post start and stop parameters) حول مناطق الانتقال في منحنى الانصهار.

قم بضبط معلمات بداية ونهاية مرحلة ما قبل الانصهار (prem melt start and stop)، بحيث يكون الفرق بينهما من 0.2 إلى 0.5 درجة Celsius. وبالمثل، قم بضبط معلمات بداية ونهاية مرحلة ما بعد الانصهار (post melt start and stop)، ثم استخرج بيانات الفرق في درجة حرارة الذروة لكل عينة باستخدام معايير النسبة المئوية للمثيلة وفروق درجات حرارة الذروة المقابلة لها.

قم بإنشاء معادلة انحدار خطي. استخدم معادلة الانحدار الخطي هذه لتقدير حالة الميثيلة في عينات مجهولة بعد تحديد جزر CPG ذات الأهمية وتضخيم واستنساخ بلازميد جزيرة CPG Luke two وفقاً للبروتوكول النصي. استخدم برنامج preferred cutter للتحقق من مواقع الهضم التقييدي لتجنب القطوع المزدوجة، وقم بجعل 30 micrograms من البلازميد خطياً بمجرد هضم العينة باستخدام الإنزيمات المناسبة.

قم بتثبيط الإنزيمات حرارياً عند درجة الحرارة والمدة المناسبتين في تفاعلات بحجم 50 µL. استخدم خمس وحدات من CPG methylate لإجراء عملية الميثيلة لـ 700 µg من البلازميدات الخطية عند درجة حرارة 30 °C لمدة تتراوح من 13 إلى 19 ساعة.

بعد تنقية الحمض النووي DNA وفقاً لما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بإجراء عملية هضم إنزيمي باستخدام HPA II على عينات من الحمض النووي DNA الميثيلي بتركيز 1 µg عن طريق التحضين عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد تنقية الحمض النووي DNA، قم بتحميل العينات على هلام أغاروز (agarose gel) بتركيز 1% عند 100 فولت لمدة 45 دقيقة للتصوير المرئي. بعد ذلك، أخضع البلازميدات الميثيلية وغير الميثيلية لعملية هضم مزدوج باستخدام إنزيمات القطع المناسبة طوال الليل لتحرير ناقل Luke two كامل الطول وقطع جزر CpG.

قم بتعطيل الإنزيمات حرارياً بعد عملية الهضم. قم بتشغيل عينات الهضم المزدوج على هلام أغاروز DNA بتركيز 1% عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة لفصل الناقل والمدرج، ثم مع ارتداء واقي من الأشعة فوق البنفسجية، ضع الهلام تحت ضوء أسود وباستخدام شفرات جراحية نظيفة، استقطع المدرجات الميثيلية وغير الميثيلية بعد استخلاص DNA من الهلام وفقاً لبروتوكول النص، واستخدم T four DNA Ligase ونسبة من واحد إلى أربعة من الناقل إلى المدرج لإعادة ربط المدرجات الميثيلية وغير الميثيلية في ناقل غير ميثيلي. قم بالتحضين عند درجة حرارة -20 °C أو على الثلج طوال الليل بعد عملية الربط.

قم بتنقية الـ DNA والتحقق من إعادة الربط (re ligation) عن طريق تشغيل العينات على هلام أغاروز DNA بتركيز 1%، وقيم تركيز البلازميد المعاد ربطه. قم بزراعة خلايا CD 54 في طبق يحتوي على 12 بئراً بكثافة 140,000 خلية لكل بئر. بعد مرور 24 ساعة، استخدم كاشف ترانسفكشن (transfection reagent) تجاري لنقل تركيزات متساوية من إما بلازميد CPG loop two غير ميثيلي مضافاً إليه RAN vanilla أو ناقل لوسيفيريز (luciferase vector) ضابط آخر، أو بلازميد CPG loop two ميثيلي مضافاً إليه ELLA أو ناقل لوسيفيريز ضابط آخر. اترك الخلايا لتخضع لعملية الترانسفكشن لمدة 24 ساعة قبل إجراء مقايسة اللوسيفيريز (luciferase assay).

وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، استخدم مقياس الضوء (luminometer) لقراءة كل بئر ثلاث مرات. احسب نسبة نشاط لوسيفيريز اليراعة (firefly luciferase) إلى نشاط لوسيفيريز الفانيليا أو أي تحكم آخر.

قم بتطبيع نشاط لوسيفيريز اليراع الضابط الميثيلي إلى نشاط لوسيفيريز اليراع الضابط غير الميثيلي عن طريق قسمة النشاط الميثيلي على نشاط luc الميثيلي. كما هو موضح هنا، تم الحصول على مجموعة غنية من الخلايا النجمية عبر فرز fax لحيوانات E-G-F-P-S 100 beta المعدلة وراثياً. تم استهداف مجموعة محددة بناءً على التشتت الأمامي والجانبي، وتحديد مجموعة الخلايا الحية باستخدام مؤشر الخلايا الميتة بالبروميد، والصور الموضحة هنا هي صور تمثيلية للخلايا النجمية الموجبة لـ EGFP بعد التفكيك، ولكن قبل الفرز وكذلك بعد الفرز، ويظهر هذا الشكل مجموعة خلايا معزولة موجبة لـ EGFP أظهرت زيادة بمقدار 40 ضعفاً في mRNA للمؤشر الخاص بالخلايا النجمية.

كانت نسبة LDH 1:1. بالإضافة إلى ذلك، وبالرغم من التعبير المشترك لـ S 100 beta و NG2 في كل من الخلايا السلفية للدبقيات قليلة التغصن (OPCs) والخلايا النجمية، فقد لوحظ انخفاض بمقدار أربعة أضعاف في mRNA لـ NG2، وهو علامة مميزة للخلايا السلفية للدبقيات قليلة التغصن، مما يشير إلى عزل مجموعة خلوية نجمية مثرية. يدرج هذا الجدول إجمالي RNA و DNA المعزول من حيوانات بأعمار وأعداد مختلفة، وهو مدرج كمرجع للإنتاج المتوقع للجزيئات الجزيئية التالية.

وأخيراً، تم استخدام مقايسة لوسيفيراز المزدوجة لتقييم النشاط النسخي للمناطق مفرطة الميثيلة في الجين المستهدف بعد نقل القطعة الميثيلية إلى ناقل غير ميثيلي. واستُخدم HPA two، الذي يهضم الحمض النووي غير الميثيلي فقط، للتحقق من حالة الميثيلة في البلازميد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل مجموعة غنية من الخلايا النجمية باستخدام تقنية FACS، بالإضافة إلى كيفية قياس ميثيلة الحمض النووي لجين ما، وربط التغيرات في ميثيلة الحمض النووي للمروج بالنشاط النسخي باستخدام تحليل الصهر عالي الدقة الحساس للميثيلة ومقايسة اللوسيفيراز على التوالي.