التصور المباشر من الفئران الظهرية القوقعة نواة لOptogenetic تحفيز من المسار السمعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الوصول جراحيا إلى نواة القوقعة الصناعية في نموذج الفأر لتمكين التجارب القائمة على علم البصريات الوراثي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الفأر أولا لبضع القحف وسحب الجلد والأنسجة الرخوة والعضلات التي تغطي فروة الرأس بشكل جانبي. كخطوة ثانية ، يتم إجراء حج القحف على العظم الجداري الأيسر ، على بعد حوالي ملليمترين من خط خياطة لامدا.

هذه المنطقة تغطي نواة القوقعة. بعد ذلك ، باستخدام خمسة أنبوب شفط فرنسي ، استنشق الجزء الجانبي الأكبر من المخيخ الأيسر الذي يغطي DCN. تظهر النتيجة عرضا خاليا من العوائق ل DCN.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب المساعدة مثل التوجيه التجسيمي في تحقيق التصور المباشر لنواة القوقعة ووضع محاكي الخلايا العصبية مثل مصدر الضوء أو مصفوفة القطب الكهربائي على سطح جذع الدماغ. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في كل من مجالات علم البصريات الوراثي والسمع. لا يوجد طرف اصطناعي ، مثل نقل الجينات يمكن تحفيز جذع الدماغ السمعي بالضوء بدقة كافية للوجه والزمان.

بعد تخدير الفأر بالكيتامين والزيلازين عن طريق الإعطاء داخل الصفاق ، تحقق من منعكس انسحاب قرص إصبع القدم ، وراقب معدل ضربات القلب ومعدل التنفس لتأكيد التخدير المناسب. ثم ضع مرهما بيطري على كلتا العينين لمنع الجفاف. بعد ذلك ، احلق الشعر المغطى بفروة الرأس لتوفير وصول دون عائق إلى موقع الجراحة.

بعد ذلك ، ضع الماوس في حامل تجسيمي صغير. اضبط مشبك الخطم بحيث يكون فضفاضا بدرجة كافية للسماح بالتنفس الكافي ، ولكنه ضيق بما يكفي لشل حركة رأس الماوس تماما. تحت المجهر ، قم بعمل شق عمودي عبر الجلد ، بدءا من خط الوسط مباشرة بين الصيوان ويمتد إلى الجزء اللطيف من القفف.

ثم قم بإزاحة الجلد بشكل جانبي. قم بإزالة العضلات التي تغطي العظام الجدارية اليسرى وبين الجدارية والقذالية للجمجمة باستخدام مشرط أو مقص قزحية. في غضون ذلك ، قلل من النزيف عن طريق الضغط اللطيف باستخدام قضيب قطني مائل لمدة 10 إلى 15 ثانية.

بعد ذلك ، حدد خطوط خيوط السهمية واللامدا. باستخدام زوج من جواهر رون. قم بعمل حج قحف على العظم الجداري الأيسر حوالي ملليمترين من خط خياطة لامدا.

هذه المنطقة تغطي DCN بعد حج القحف. يجب ملاحظة طبقة رقيقة من الجافية التي تغطي المخيخ إزالتها بعناية باستخدام شفرة مشرط. قم بإزالة الدم المتخثر بأطراف قطنية أو قم بتقطير المحلول الملحي برفق على المخيخ لإزالة الدم.

ثم استخدم أنبوب شفط فرنسي خماسي لشفط الجزء الجانبي الأكبر من المخيخ الأيسر ، مع تغطية DCN للمساعدة. في الشفط ، اضبط المستوى البؤري للمجهر على العمق المتوقع لنواة القوقعة الصناعية لتحسين التصور وضمان صورة حادة. قم بإزالة ما يقرب من ربع إلى ثلث المخيخ الأيسر.

المعلم الرئيسي المجاور ل DCN هو AM للقناة نصف الدائرية العليا. بعد الشفط ، سيظهر المزيد من النزيف وتراكم السائل النخاعي وإزاحة المخيخ على DCN في غرس المحلول الملحي بسرعة في حج القحف لمنع تخثر الدم. استخدم مزيجا من التربيت اللطيف مع نقطة الأسنان والشفط لتمهيد الطريق للتصور المباشر ل DCN.

بعد أن يكون DCN مرئيا بوضوح وخاليا من الدم المغطى و CSF ، قم بإجراء حقن دقيق للضغط للناقل فيه باستخدام حقنة هاميلتون ضيقة بالغاز بسعة خمسة ميكرولتر. استخدم إبرة قياس 34 مع شطبة ضحلة لتقليل الصدمة الحادة وتوطين حجم الحقن داخل DCN. ثم أدخل الإبرة ببطء باستخدام مناور دقيق حتى لا يكون الطرف مرئيا تحت سطح DCN.

ابدأ بحقن 1.5 ميكرولتر من الناقل. بعد الانتهاء من ذلك ، اسحب الإبرة ببطء ، ثم أعد تقريب الجلد واسمح للفأر بالتعافي وفقا لإجراء الاسترداد القياسي. بعد أسبوعين إلى أربعة أسابيع من الشفاء وحضانة نقل الجينات بوساطة الفيروس ، أعد تخدير الفأر المحقون بالناقل ، ثم قم بإزالة النسيج الندبي فوق موقع حج القحف.

بعد ذلك ، حدد مزيجا من المخيخ المتبقي والأنسجة الندبية التي تغطي DCN. استخدم شفطا فرنسيا خماسيا لشفط المخيخ والأنسجة الندبية العلوية. بعد الطموح.

ضع المحلول الملحي بسرعة في حج القحف. لمنع تساقط الدم ، استخدم مزيجا من التربيت اللطيف على نقطة الأسنان والشفط لتمهيد الطريق للتصور المباشر ل DCN. يمكن الوصول إلى DCN الآن لتجارب علم وظائف الأعضاء القائمة على علم البصريات الوراثي الموضحة هنا هو وضع ألياف الليزر مباشرة على سطح DCN ، مما يسمح بالتحفيز البصري لسلسلة نبضات الضوء الأزرق DCNA المصابة ب opsin على سطح نتائج DCN المصابة باستجابة جذع الدماغ السمعية مدفوعة بصريا.

باستخدام مناور دقيق ، يتم وضع ألياف ضوئية مقترنة بليزر الضوء الأزرق مباشرة على سطح نواة القوقعة الصناعية وتشغيلها. هنا يمكننا تحديد الضوء الأزرق النبضي على سطح نواة القوقعة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل محاكاة النواة كهربائيا ، مما يسمح لنا بمقارنة ليس فقط الاستجابات العصبية المستحثة صوتيا ، ولكن أيضا الاستجابات العصبية المستحثة كهربائيا مع تلك التي تثيرها المحاكاة البصرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وإجراء بضع القحف وشفط المخيخ مع الهدف النهائي المتمثل في التصور المباشر والوصول إلى نواة القوقعة.