الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically
December 27th, 2013
نصف طريقة لتوصيف التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية لدوائر الدماغ الأمامي باستخدام نهج بصري وراثي لتحفيز مجموعات الخلايا العصبية في المختبر.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق تقنيات البصريات الوراثية الحديثة لتحفيز المسارات العصبية المستهدفة بالصور في مستحضرات الشرائح في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن قضيب القناة Dossin في خطوط الخلايا العصبية ذات الأهمية. الخطوة الثانية من الإجراء هي إجراء مستحضرات شريحة حادة لهياكل الدماغ ذات الصلة المراد دراستها.
الخطوة التالية هي تسجيل الاستجابات من الخلايا العصبية في تحضير الشريحة استجابة للتحفيز الضوئي للقناة ، حيث يعبر قضيب دوسين عن الألياف. الخطوة الأخيرة هي تصوير توزيع قناة opsin التي تعبر عن الخلايا العصبية والألياف. في النهاية ، يتيح هذا النهج تقييم التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية للدوائر العصبية باستخدام تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر للمكونات العصبية المستهدفة بصريا.
تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على طرق التحفيز الكهربائي التقليدية في القدرة على استهداف وتحفيز أنواع معينة من الخلايا العصبية على وجه التحديد وفحص إسقاطاتها بعيدة المدى في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب للأنظمة ، مثل التنظيم الوظيفي لمآخذ الحرب المعقدة. قم بإعداد حقنة وإبرة لحقن المحلول الفيروسي الذي يحتوي على أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من البولي لتعزيز التعداد.
ثم حقن الضغط 200 نانولتر من المحلول باستخدام مضخة المحقنة ، بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، سيكون هناك تعبير كاف عن شريحة دوسين قضيب القناة. يجب إجراء التحضير في أسرع وقت ممكن بعد إزالة الدماغ المحقون ، قم بعمل كتلة من الدماغ في الاتجاه المطلوب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك ، قم بلصق السطح المسدود للدماغ على مرحلة القطع باستخدام غراء لاصق فوري.
ثم انقل المرحلة إلى غرفة قطع الاهتزاز المبردة بالفريزر واسكب السائل الدماغي النخاعي المثلج في غرفة التقطيع. قم بتقطيع أقسام الدماغ باستخدام فيوم إلى أقسام بسمك أربعة إلى 500 ميكرون. انقل شرائح الدماغ إلى غرفة احتجاز مؤكسجة واتركها تحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الشروع في التجربة.
عندما تكون جاهزا لبدء التجربة ، انقل شريحة الدماغ إلى مرحلة جهاز التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. سجل خلية عصبية باستخدام تقنيات مشبك رقعة الخلية الكاملة القياسية. ضع ماصة التسجيل بجانب الخلية العصبية لفترة وجيزة أثناء الضغط الإيجابي على الماصة.
بعد التلامس مع الخلية ، حرر الضغط وقم بتطبيق الشفط لتشكيل ختم الجيجا. ثم قم بتطبيق شفط قصير لكسر الغشاء لتكوين الخلية بأكملها والتقاط التسجيلات في أوضاع الجهد أو المشبك الحالي. قم بتشغيل الماسح الضوئي بالليزر إما باستخدام موجة المد والجزر أو برنامج الحصول على بيانات EFAs.
يجب معايرة البرنامج على الصمام الثنائي للصور قبل استخدامه للتحكم في قوة الليزر. يتم وضع عجلة متغيرة الكثافة المحايدة في مسارها يؤدي تدوير العجلة إلى ضبط قوة الليزر عن طريق القياس في المستوى البؤري الخلفي.
عادة ما يتم ضبط الطاقة على ما بين 25 و D مللي واط. تتحكم معلمة النبض في الغالق في طول وتوقيت التحفيز في البرنامج. يمكن عمل صورة للمنطقة المراد تحفيزها من وظيفة الاستيلاء على الفيديو.
بعد ذلك ، قم بتعيين شبكة التحفيز مثل شبكة 16 × 16 مع تباعد 80 ميكرون. ثم قم بتراكب الشبكة على الصورة المكتسبة واضبط إحداثيات XY ودرجة الإزاحة لتحسين الاتجاه لبدء التحفيز. قم بتنشيط وظيفة الخريطة.
يتم الاحتفاظ بالبيانات ويمكن تحليلها باستخدام برنامج التحليل غير المتصل بالإنترنت في موجة المد والجزر ، أو يمكن تحليلها باستخدام برنامج تحليل الخريطة في برنامج EFAs. بعد الانتهاء من التسجيلات الفسيولوجية على الشريحة ، يمكن توثيق نمط التعبير عن opsin القناة الموسومة YFP. أولا ، قم بإصلاح الشريحة طوال الليل في 4٪ PFA في 0.01 مولار PBS عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، انقل الشريحة إلى محلول 30٪ سكروز 4٪ PFA لحماية التبريد طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقص 50 ميكرون من الشريحة على ناظم البرد. اشطف الشرائح في PBS وقم بتثبيتها للتصوير باستخدام وسيط مضاد للبهتان في المجهر متحد البؤر.
بعد العثور على منطقة الاهتمام في الضوء الأبيض ، استخدم طولا موجيا مثيرا يبلغ 514 نانومترا وطولا موجيا للانبعاث 527 نانومتر. لتصوير البنية الفيروسية YFPA التي تقود التعبير عن قضيب القناة دوبسون ، EYFP. في الخلايا العصبية الجلوتاماتية المثيرة تم حقنها في القشرة البصرية الأولية لفأر BSY.
تم العثور على التعبير الفيروسي في المسارات بين القشرة البصرية الأولية والثانوية ، وفي ألياف المهاد القشرية لتسجيل مشبك تصحيح الخلية الكاملة LGN من خلية عصبية في القشرة البصرية الثانوية التي تميزها النجم عن e PSCs. بعد تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر للقناة ، يعبر قضيب دوسين عن الألياف في الطبقات السفلية من V اثنين من إسقاطات المهاد القشرية من الطبقة السادسة من القشرة الحسية الجسدية الأولية. تمت دراسة النواة الخلفية البطنية باستخدام نهج CRE LAX للتعبير عن قضيب القناة dossin في الخلايا العصبية المهادية القشرية السادسة ، وفي إسقاطاتها كما هو متوقع ، أدى التعدي من قبل بناء A A V في فأر معدل وراثيا CRE إلى تعبير قضيب القناة في الطبقة المستهدفة الستة من الخلايا العصبية وأليافها الممتدة إلى الطبقة الرابعة.
قضيب القناة دوبسون ، لوحظ تعبير EYFP أيضا في الألياف التي تسقط على التسجيلات الفسيولوجية VP من خلية عصبية VP. كشف استخدام مشبك تصحيح الخلية بالكامل أنه يمكن استنباط e PSCs بعد التحفيز الضوئي بالقرب من الخلايا العصبية المسجلة ، والتي تتميز بالنجم. يصور التحليل غير المتصل بالإنترنت متوسط سعة الاستجابة لتحفيز الصورة في VP تم استئصال شرائح 50 ميكرون من الخلايا العصبية المهادية القشرية السادسة التي تعبر عن قناة Rodin EYFP كشفت عن نمط دقيق من الألياف المصنفة التي تعبر من الطبقة السادسة إلى الطبقة الرابعة حيث تنتهي وشجرة على نطاق واسع.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت ألياف المهاد القشرية تدخل المادة البيضاء وتعبر نحو المهاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق تقنيات البصريات الوراثية الحديثة لتحفيز الصور على المسارات العصبية المستهدفة في مستحضرات الشرائح في المختبر. لا تنس أن العمل باستخدام الليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية عند تنفيذ خطوات المعايرة المرتبطة بهذا الإجراء.
ارتد نظارات واقية.
المراجعة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحديد دوائر الدماغ الأمامي باستخدام التقنيات الضوئية الجينية لتحفيز الخلايا العصبية في المختبر. تتيح هذه التقنية تقييم التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية للدوائر العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التقنيات الضوئية الجينية
- الفيزيولوجيا الكهربائية
الخلفية
- تتيح التقنيات الضوئية الجينية التحكم الدقيق في النشاط العصبي.
- يتم استخدام تحضيرات الشرائح في المختبر لدراسة دوائر الدماغ.
- يعتبر الكانالرودوبسين أداة رئيسية للتحفيز الضوئي.
- توفر هذه الطريقة رؤى حول تنظيم الدوائر العصبية.
غرض الدراسة
- لتطبيق التقنيات الضوئية الجينية للتحفيز العصبي المستهدف.
- لدراسة الخصائص المشبكية للمسارات العصبية المحددة.
- لتعزيز فهم التنظيم الوظيفي في الدماغ.
الطرق المستخدمة
- تعبير الكانالرودوبسين في خطوط الخلايا العصبية.
- تحضير شرائح الدماغ الحادة للتجارب.
- تسجيلات فيزيولوجية كهربائية باستخدام تقنيات تثبيت التصحيح الخلوي الكامل.
- تحفيز ضوئي بالمسح بالليزر لتنشيط مجموعات عصبية معينة.
النتائج الرئيسية
- تحفيز ضوئي ناجح للألياف التي تعبر عن الكانالرودوبسين.
- تسجيل الاستجابات المشبكية في الخلايا العصبية المستهدفة.
- تصور المسارات العصبية وإسقاطاتها.
- رؤى حول الاتصال الوظيفي لدوائر الدماغ الأمامي.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أداة قوية لدراسة الدوائر العصبية.
- تتيح التقنيات الضوئية الجينية الاستهداف والتحفيز المحدد للأنواع العصبية.
- يمكن لهذا النهج الإجابة على أسئلة حاسمة في علم الأعصاب النظامي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Laser-scanning photostimulation of optogenetically targeted forebrain circuits enables precise interrogation of neuronal connectivity and synaptic function in complex brain regions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing targeted hypothesis testing of circuit-level mechanisms. The method supports portfolio decisions by clarifying functional organization and de-risking biological targets in neuropsychiatric and neurodegenerative research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted interrogation of neuronal pathways to clarify circuit-level mechanisms.
- Supports functional target validation by isolating specific cell types and projections.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS disorders.
- Provides data to triage targets based on synaptic and connectivity profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes stimulation and recording conditions for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable mapping of synaptic responses across defined neuronal populations.
- Supports reliable evaluation of compound effects on circuit function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit mapping with disease-relevant brain regions and pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neural targets.
- De-risks translational advancement by linking synaptic properties to in vivo function.
- Supports biomarker development through quantifiable electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neuronal circuits, supporting both target validation and assay development for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective stimulation and recording from defined neuronal populations.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound screening in validated slice systems.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic responses and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Links in vitro circuit function to disease-relevant models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mapping diverse brain circuits and evaluating multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic stimulation and electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying circuit-level mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral transfection, and electrophysiology.
- Needs specialized instrumentation for laser-scanning, patch clamp, and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization of stimulation and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or transgenic models.
- Safety protocols for laser use and viral handling are essential.
