الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق تقنيات علم البصريات الوراثي الحديثة لتحفيز مسارات عصبية مستهدفة ضوئياً في تحضيرات شرائح مخبرية (in vitro). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن channel rod Dossin في الخطوط الخلوية العصبية المطلوبة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي عمل تحضيرات لشرائح حادة من هياكل الدماغ ذات الصلة المراد دراستها.

تتمثل الخطوة التالية في تسجيل استجابات العصبونات في تحضيرة الشريحة استجابةً للتحفيز الضوئي للألياف التي تعبر عن أوبسين القناة (channel opsin). أما الخطوة النهائية فهي تصوير توزيع العصبونات والألياف التي تعبر عن أوبسين القناة. وفي النهاية، يتيح هذا النهج تقييم الطبوغرافيا الوظيفية والخصائص التشابكية للدوائر العصبية باستخدام التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للمكونات العصبية المستهدفة وراثياً بالضوء.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق التحفيز الكهربائي التقليدية في القدرة على استهداف وتحفيز أنواع معينة من الخلايا العصبية بشكل محدد وفحص إسقاطاتها طويلة المدى في المختبر (in vitro). ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علوم الأعصاب النظمية، مثل التنظيم الوظيفي للمقابس الحربية المعقدة. قم بتجهيز حقنة وإبرة لحقن المحلول الفيروسي، الذي يحتوي على 4 µg/mL من poly لتعزيز عملية عفن التحول (transfection).

بعد ذلك، يتم حقن 200 nanoliters من المحلول باستخدام مضخة سرنجة؛ وبعد مرور أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، سيحدث تعبير كافٍ في شريحة Dossin لقضيب القناة. يجب إجراء التحضير بأسرع ما يمكن. بعد إزالة الدماغ المحقون، يتم تقطيع الدماغ إلى كتلة بالاتجاه المطلوب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك، يتم تثبيت السطح المقطوع من الدماغ على منصة القطع باستخدام غراء لاصق سريع.

بعد ذلك، انقل المنصة إلى غرفة تقطيع vibram مبردة في المجمد، واسكب A CSF باردًا جدًا في غرفة التقطيع. قم بتقطيع أقسام الدماغ باستخدام viome إلى أربعة أو خمسة أقسام بسمك 500 micron. انقل شرائح الدماغ إلى غرفة حفظ مؤكسجة واتركها تحضن عند 30 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل المتابعة في التجربة.

عند الاستعداد لبدء التجربة، انقُل شريحة الدماغ إلى منصة جهاز التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي. قم بتسجيل عصبون باستخدام تقنيات تثبيت الرقعة للخلية الكاملة القياسية. قم بوضع ماصة التسجيل بالقرب من العصبون لفترة وجيزة مع تطبيق ضغط إيجابي على الماصة.

بعد إتمام الاتصال بالخلية، قم بتخفيف الضغط وتطبيق قوة شفط لتكوين الختم العملاق (giga seal). بعد ذلك، طبق شفطاً قصيراً لكسر الغشاء من أجل ضبط تكوين الخلية الكاملة، ثم قم بإجراء التسجيلات في وضعي تثبيت الجهد أو تثبيت التيار. قم بتشغيل الماسح الليزري باستخدام برنامج الحصول على البيانات tidal wave أو EFAs.

يجب معايرة البرنامج وفقاً للثنائي الضوئي قبل الاستخدام للتحكم في قدرة الليزر. يتم وضع عجلة كثافة متعادلة متغيرة في مساره، حيث يؤدي تدوير العجلة إلى ضبط قدرة الليزر عن طريق القياس عند المستوى البؤري الخلفي.

تُضبط القدرة عادةً لتكون بين 25 و D ميلي وات. وتتحكم معلمة النبضة الخاصة بالغالق في طول وتوقيت التحفيز في البرنامج. كما يمكن التقاط صورة للمنطقة المراد تحفيزها باستخدام وظيفة التقاط الفيديو.

بعد ذلك، قم بضبط شبكة التحفيز لتكون شبكة 16 × 16 وبتباعد قدره 80 micron. ثم ضع الشبكة فوق الصورة المكتسبة وقم بتعديل إحداثيات XY ودرجة الإزاحة لتحسين التوجيه لبدء التحفيز. قم بتنشيط وظيفة الخريطة.

يتم الاحتفاظ بالبيانات ويمكن تحليلها باستخدام برنامج التحليل غير المتصل بالشبكة في tidal wave، أو يمكن تحليلها باستخدام برنامج تحليل الخرائط في برنامج EFAs. بعد الانتهاء من التسجيلات الفسيولوجية على الشريحة، يمكن توثيق نمط تعبير channel opsin الموسوم بـ YFP. أولاً، يتم تثبيت الشريحة طوال الليل في 4%PFA في 0.01 molar PBS عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

في اليوم التالي، يتم نقل الشريحة إلى محلول 30% sucrose و 4% PFA للحماية من التجمد طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم قطع مقاطع بسمك 50 micron من الشريحة باستخدام جهاز القطاع المبرد (cryostat). تُشطف الشرائح في PBS ثم تُثبت للتصوير باستخدام وسط مانع للتلاشي (anti fade medium) في المجهر البؤري (confocal microscope).

بعد تحديد المنطقة المستهدفة باستخدام الضوء الأبيض، استخدم طول موجة استثارة يبلغ 514 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 527 نانومتر. لتصوير بناء فيروسي YFPA الذي يحفز تعبير قناة rod Dobson، EYFP. تم حقن الخلايا العصبية الغلوتاماتيرجية الاستثارة في القشرة البصرية الأولية لفأر BSY.

وُجد التعبير الفيروسي في المسارات الواقعة بين القشرتين البصريتين الأولية والثانوية، وفي الألياف القشرية المهادية للنواة الركبية الوحشية (LGN). وأظهر تسجيل تثبيت الرقعة للخلية الكاملة من عصبون في القشرة البصرية الثانوية، والمشار إليه بالنجمة، وجود تيارات ما بعد المشبك الاستثارة (e PSCs). وعقب التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للقناة، ظهرت الألياف المعبرة عن Channelrhodopsin في الطبقات السفلية من V2. كما تمت دراسة الإسقاطات القشرية المهادية من الطبقة السادسة للقشرة الحسية الجسدية الأولية إلى النواة الخلفية البطنية باستخدام منهج CRE LAX للتعبير عن Channelrhodopsin في عصبونات الطبقة السادسة القشرية المهادية وفي إسقاطاتها. وكما هو متوقع، أدى نقل AAV المنقّى إلى فأر معدل جينياً بنظام CRE إلى التعبير عن Channelrhodopsin في عصبونات الطبقة السادسة المستهدفة وأليافها الممتدة إلى الطبقة الرابعة.

لوحظ أيضاً تعبير EYFP في الألياف التي تمتد إلى VP عند تسجيلات فيزيولوجية من عصبون في VP. وكشف استخدام تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp) أنه يمكن استثارة e PSCs بعد التحفيز الضوئي بالقرب من العصبون المسجل، والمشار إليه بالنجمة. يوضح التحليل غير المتصل بالشبكة متوسط سعة الاستجابة للتحفيز الضوئي في VP. كشفت شرائح مقطعة بمقدار 50 ميكرون من عصبونات الطبقة السادسة القشرية المهادية التي تعبر عن channel Rodin EYFP عن نمط دقيق من الألياف المحددة التي تعبر من الطبقة السادسة إلى الطبقة الرابعة حيث تنتهي وتتفرع بشكل مكثف.

بالإضافة إلى ذلك، لوحظ دخول الألياف القشرية المهادية إلى المادة البيضاء وعبورها باتجاه المهاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تطبيق تقنيات علم البصريات الوراثي الحديثة لتحفيز المسارات العصبية المستهدفة ضوئياً في تحضيرات الشرائح المختبرية (in vitro). لا تنسَ أن العمل باستخدام الليزر يمكن أن يكون خطيراً للغاية عند تنفيذ خطوات المعايرة المرتبطة بهذا الإجراء.

ارتدِ نظارات واقية.