رقاقة ميكروفلويديك لICPMS مقدمة عينة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج وتحليل التركيب العنصري كمياً لقطيرات مجهرية أحادية التشتت تحتوي على خلايا مفردة أو محاليل مائية باستخدام تقنية I-C-P-M-S. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع شريحة مائعية مجهرية باستخدام القولبة المتكررة بواسطة PDMS. وتتمثل الخطوة الثانية في توصيل مضخات حقنة بالشريحة المائعية المجهرية.

ستقوم المضخات بتزويد العينة المائية والطور الحامل PFH العضوي أو المسموح به وشديد التطاير. عند تشغيل مضخة الحقنة، تنتج الشريحة الموائع ميكروية التدفق قطرات أحادية التشتت من محلول العينة المائية أو معلق خلوي عن طريق تركيز التدفق باستخدام PFH، ثم تقذف هذه القطرات مع PFH إضافي من الشريحة على شكل نفاث سائل. تتمثل الخطوة النهائية في إدخال الشريحة في وحدة نقل تتكون من سخان خرطوشة يعمل على تبخير القطرات ومزيل للمذيبات الغشائي يقوم بإزالة المذيبات قبل تأيين وكشف محتويات القطرات بواسطة I-C-P-M-S.

في النهاية، تُستخدم الإشارات المسجلة وقياس المعايرة باستخدام محلول قياسي لتحديد التركيب العنصري للمحلول العينة أو الخلايا الموجودة في المعلق. وتتمثل المزايا الرئيسية لتقنيتنا الموائعية الدقيقة مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية ضبط حجم القطيرات، وانخفاض استهلاك العينة، وانخفاض خطر الانسداد عند العمل مع معلقات الخلايا أو محاليل الملح المركزة. علاوة على ذلك، فإن الشريحة الموائعية الدقيقة منخفضة التكلفة والقابلة للتخلص منها تغني عن وقت التنظيف وتمنع التلوث الخلطي.

سيقوم بتوضيح الإجراء كل من vin sc، طالب دكتوراه من مختبر الأستاذ GTA، وPascal Fabrica، طالب دكتوراه من مختبري. لبدء عملية التصنيع الدقيق (MICROFABRICATION)، قم بقياس 40 grams من PDMS وأربعة grams من عامل معالجة PDMS في طبق بلاستيكي كبير. اخلط كلا الجزأين بالتساوي باستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، وضع الطبق داخل مجفف تفريغ لمدة تتراوح من 20 إلى 30 minutes للتخلص من جميع الفقاعات الموجودة في الخليط.

أثناء عملية إزالة الغازات، ضع قالب صب فوق رقاقة سيليكون ذات بنية دقيقة، واستخدم هيكل التوجيه المحيط بالتصميم لتثبيته في مكانه على رقاقة سيليكون مسطحة. ثم ضع قالب صب آخر فوقه بحرية.

صُب حوالي ثلاثة إلى أربعة جرامات من خليط Degas PDMS على كلا قالبي الصب. انقل رقائق السيليكون إلى السخان الكهربائي (hot plate). قم بمعالجة PDMS عند 150 °C لمدة ست دقائق، ثم اتركه ليبرد.

قم بتجميد هياكل PDMS على المنضدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام ملعقة معدنية. افصل كتل PDMS الصلبة بعناية عن القوالب. احمِ أسطح الربط في كلا الكتلتين من تلوث الجسيمات وبصمات الأصابع.

من خلال وضع طبقة من شريط لاصق شفاف، يمكن الآن التعامل مع قطع PDMS وقصها إلى الحجم المطلوب باستخدام المقص. بعد القص، قم بإزالة الشريط اللاصق من كتلة PDMS ذات البنية المجهرية واستخدم أداة ثقب الخزعات لإنشاء منافذ الإدخال للموائع الدقيقة. بهذا تكتمل عملية تصنيع النصف ذو البنية المجهرية من الجهاز، وهو الآن جاهز للربط والتجميع مع نظيره المسطح.

لتحضير الأسطح من أجل ربط PDMS بـ PDMS، ابدأ بطلاء طبقة من عامل معالجة PDMS باستخدام الطلاء الدوراني على رقاقة سيليكون فارغة بسرعة 6,000 RPM لمدة 30 ثانية. وبينما لا يزال عامل المعالجة رطباً، اجعل واجهة الربط لكتلة PDMS ذات البنية المجهرية تلامس الرقاقة، ثم اضغط بلطف على الجزء العلوي من PDMS لتشكيل ختم سلس خالٍ من الفقاعات. وفي خطوة منفصلة، قم بإزالة الشريط الواقي من القطعة المقابلة المسطحة. بعد ذلك، افصل PDMS ذو البنية المجهرية ببطء عن رقاقة السيليكون.

قم بمحاذاة قطعتي الـ PDMS بعناية واجعل واجهتي الربط في حالة تلامس. اضغط برفق على الكتلتين لإزالة أي فقاعات بينية، ثم اترك شريحة الـ PDMS المجمعة لتتصلب لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وباستخدام سكيني خدمات وجهاز محاذاة، قم بإجراء قطع على طول خط المؤشر بشكل عمودي على فوهة المخرج. افحص الشريحة تحت المجهر للتحقق من وجود عيوب في القص أو تلوث بجزيئات بالقرب من فوهة المخرج المكشوفة.

بعد تقييم جودة التصنيع، تصبح الأسطح الداخلية للقناة الدقيقة المصنوعة من PDMS جاهزة للمعالجة بالسيلان. داخل خزانة الغازات، قم بتوصيل أحد طرفي زجاجة ولف بمصدر نيتروجين جاف، ووصل الطرف الآخر من الزجاجة بفتحات الدخول في شريحة PDMS. وباستخدام أنابيب متعددة متصلة بمجمع مركزي، قم بنقل 50 µL من السيلان إلى زجاجة ولف ثم أغلق الغطاء العلوي بإحكام.

قم بتشغيل تدفق النيتروجين الحامل وقم بغسل القنوات الدقيقة ببخار يحتوي على محلول ملحي لمدة 20 دقيقة بمعدل تدفق يبلغ حوالي 1 mL/s تقريبًا. وأخيرًا، افصل أنابيب الإدخال عن زجاجة وولف (wolf bottle). وبذلك تصبح رقائق PDMS المطلية جاهزة لتجارب مطيافية الكتلة لإجراء قياسات مطيافية الكتلة للخلية الواحدة.

أولاً، قم بتخفيف العينة المدخلة باستخدام محلول منظم مناسب بحيث يكون التركيز الخلوي الفعلي أقل من 10 million cells per milliliter. وتحضيراً لقياس الطيف الكتلي، ابدأ بتوصيل الأنابيب بمحاقن العينات. املأ محقنتين بسعة five milliliter من PFH، وضع العينة المدخلة في محقنة منفصلة سعتها one milliliter. قم بإزالة جميع الفقاعات المحتبسة داخل المحاقن والأنابيب، ثم ضع المحقنتين على مضخة محاقن.

تأكد من محاذاة أنبوب النقل بشكل صحيح وتوصيل جميع أنابيب الغاز. بعد ذلك، قم بتوصيل أنابيب المحقنة بمنافذ الإدخال لشريحة PDMS وقم بتشغيل مضخة المحقنة لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. خلال عملية تثبيت التدفق هذه، قم بإزالة أي سائل زائد من منفذ المخرج باستخدام منديل ورقي.

إذا لم يشكل السائل الخارج من الشريحة نفثًا مستقيمًا، فحاول بعد مرور خمس دقائق مسح أي انسدادات محتملة عند مخرج الشريحة باستخدام منديل نظيف. وفي حال عدم نجاح ذلك، تخلص من الشريحة الحالية واستبدل الوصلة بشريحة جديدة.

قم بإزالة السدادة من محول الرشاش الإعصاري وأدخل شريحة PDMS ذات التدفق المستقر بعناية في المحول. قم بتغيير معدل التدفق وفقاً للإعدادات الموصى بها، وأعد تثبيت التدفق لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق. في الوقت ذاته، قم بضبط معدلات تدفق جميع الغازات حتى يتم الوصول إلى أقصى شدة إشارة للمادة المراد تحليلها.

كذلك، قم بضبط قدرة البلازما وجهد عدسة التركيز في مطياف الكتلة لتعزيز شدة الإشارة بشكل أكبر عند تحسين الإشارة. اضبط مطياف الكتلة على زمنماكث قدره 10 milliseconds وابدأ في جمع البيانات. بعد القياسات، انقل البيانات الخام إلى برنامج تحليل البيانات.

في إجراء تحليل البيانات النموذجي، يتم أولاً تقسيم جميع القياسات إلى مجموعات بيانات (bins)، حيث تمثل كل مجموعة عدد العدات لكل 10 milliseconds من زمن المكوث (dwell time)، ثم يتم إنشاء مخطط مدرج تكراري لجميع المجموعات ومطابقته مع دالة توزيع غاوس (Gaussian distribution function). ويمثل المتوسط والمدى لكل عملية مطابقة كلًا من متوسط شدة الإشارة والانحراف المعياري عند نسبة كتلة إلى شحنة محددة. لبدء عملية المعايرة، قم أولاً بقياس محلول قياسي بنفس معدل التدفق المستخدم في عينتك.

باستخدام شريحة PDMS لتوليد القطيرات، قم بتجهيز محقنتين سعة 5 mL لـ PFH ومحقنة واحدة سعة 1 mL للمحلول القياسي. ثم باستخدام طبق بتري كحامل لعينات المجهر، ضع شريحة PDMS في طبق بتري واضبط تركيز الشريحة تحت تكبير منخفض محاكاةً لخطوات البروتوكول السابقة. قم بتثبيت عملية توليد القطيرات داخل القناة الميكروية لشريحة PDMS لمدة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق باستخدام كاميرا عالية السرعة.

ابدأ بتسجيل صور القطيرات المائية على الشريحة عند التقاطع الثانوي للحصول على متوسط قطر القطيرة من التسجيلات. استخدم برنامجاً لتحليل الصور يحتوي على مجموعة أدوات مخصصة لتحليل شكل القطيرات وقياساتها البصرية وتناظر سرعتها. وبافتراض إمكانية نمذجة كل قطيرة كجسم كروي، يمكن تقدير متوسط حجم القطيرة باستخدام متوسط قطر القطيرة الذي تم الحصول عليه بواسطة البرنامج.

بعد ذلك، اقسم تركيز المادة التحليلية المعروف في العينة على متوسط حجم القطيرة للحصول على كتلة المادة التحليلية الموجودة في قطيرة واحدة. ثم حول الكتلة الناتجة إلى عدد الذرات. وأخيرًا، احسب كفاءة الكشف الإجمالية عن طريق قسمة عدد الأيونات المقاسة لكل قطيرة على النتيجة السابقة.

يمكن الآن استخدام كفاءة الكشف هذه ككمية معايرة لتحديد عدد الذرات في عينة مجهولة. وباستخدام مولد قطرات ميكروفلويديك، يمكن تغليف خلايا مفردة داخل قطرات مائية أحادية التشتت بقطر متوسط يقل عن 50 microns، وتحليلها بواسطة I-C-P-M-S. كما يمكن إزالة غلاف PFH العضوي المحيط بالقطرة المائية بسهولة قبل وصول العينة إلى كاشف I-C-P-M-S.

عند قياس المحاليل، يمكن ملاحظة التشتت الأحادي العالي للقطرات من خلال التباينات المنخفضة بين مجموعات الإشارات القادمة من عداد قطرة واحدة أو قطرتين أو ثلاث قطرات ضمن زمن بقاء محدد. وبعد إجراء المعايرة المناسبة، يمكن تحديد محتوى الحديد من مجموعة من خلايا الدم الحمراء البقرية المفردة، حيث تكون كل خلية معلقة في قطرات مفردة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحضير واستخدام هذه الرقاقات الموائعية الدقيقة للتحليل العنصري الكمي لأحجام العينات الصغيرة جداً أو الجسيمات والخلايا المفردة.

يتطلب تصنيع هذه الرقاقات أقل من 15 دقيقة من وقت العمل اليدوي لكل رقاقة إذا تم تنفيذ العملية بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، تتيح الرقاقات سهلة التعديل دمج وحدات مائعية مجهرية إضافية للمعالجة المسبقة المتقدمة للعينات، والتقديم المتزامن للعينات والمعايير لتحسين الكفاءة ومعدل إنتاجية العينات.