A منصة ميكروفلويديك لتجهيز الدقة الصغيرة الحجم عينة واستخدامها لحجم الجسيمات البيولوجية منفصلة مع Microdevice الصوتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء عمليات فصل تلقائية للجسيمات صغيرة الحجم باستخدام جهاز ضوئي ميكروفلويديك. يمكن أن تمكن هذه الطريقة من الإجراءات الرئيسية في مجال الهندسة الطبية الحيوية ، بما في ذلك المعالجة القوية وفصل العينات للكشف الحيوي وتطبيقات البحث السريري. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في النمطية والدقة والمتانة والأتمتة ، مما يجعلها قابلة للتكيف والمرونة ليس فقط للفصل الشبكي ، ولكن أيضا مجموعة متنوعة من التدفق عبر أجهزة فصل الموائع الدقيقة.

أدركنا أولا الحاجة إلى هذه القدرة على إجراء عمليات الفصل بشكل روتيني وموثوق على أحجام العينات البيولوجية دون المليمتر دون تخفيف كبير أو فقدان التحليل يعد تكامل قياس العينات والتوجيه الآلي من ملفات المصدر إلى التجميع جنبا إلى جنب مع عمليات مضخة الحقنة القياسية أمرا بالغ الأهمية للعمل بنجاح على هذا النطاق. للبدء في تصميم جهاز الشبكية الصوتية وتخطيط أقنعة الصور كما هو موضح في القسم الأول من بروتوكول النص المصاحب.

ثم قم بتصميم منافذ السوائل الخلفية على جانب مزدوج مصقول 1 0 0 رقاقة سيليكون. باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية المقاومة الإيجابية القياسية ، قم بحفر هذه الهندسة باستخدام نقش أيوني تفاعلي عميق على عمق 350 إلى 400 ميكرومتر. بعد ذلك ، اقلب الرقاقة وقم بتصميم هندسة قناة السائل الأمامية.

مرة أخرى ، باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية المقاومة الإيجابية القياسية ، ثم قم بتركيب الرقاقة المزخرفة على رقاقة حامل سيليكون فارغة ثانية. باستخدام مقاومة الصور الآن حفر القنوات المكشوفة على عمق 200 ميكرومتر. باستخدام نقش أيون عميق التفاعل ، ثم انقع رقاقة الجهاز في محلول تجريد مقاوم لإخراجها من رقاقة السيليكون الفارغة.

بعد ذلك ، قم بتنظيف رقاقة الجهاز ورقاقة زجاجية بدون ميزات بسمك 0.5 ملم باستخدام محلول سمكة البيرانا. بمجرد تنظيف التنظيف ، أغلق قنوات السوائل ، وتربط الزجاج ورقاقة السيليكون أيونيا باستخدام الشروط الموضحة هنا. أخيرا ، قم بقطع الرقائق الفردية بشفرة ماسية على منشار مكعبات من مجموعة إيبوكسي منخفضة اللزوجة مكونة من مكونين.

قم بوزن النسبة الموصى بها لكلا المكونين واخلطهما جيدا. ثم ضع سيراميك الرصاص Zirkin eight titanate أو PCT piezo في رقصة مناسبة واستخدم ماصة لنشر ما يقرب من 10 ميكرولتر من خليط الإيبوكسي بالتساوي عبره لإنشاء طبقة رقيقة متساوية. بعد ذلك ، ضع الشريحة في الرقصة وقم بمحاذاة جانب الإيبوكسي من سيراميك البيزو مع شريحة الموائع الدقيقة.

قد يكون من الضروري تثبيت الشريحة بشريط لاصق لتثبيتها في مكانها أثناء المحاذاة. قم بتثبيت التجميع في نائب مع الحرص على عدم تكسير أي من المكونات ومعالجة درجة الحرارة والمدة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للإيبوكسي. بعد أن يجف الإيبوكسي ، استخدم مكواة لحام ذات طرف ناعم لتوصيل أسلاك قياس دقيقة بكل جانب من سيراميك البيزو.

إذا لزم الأمر ، استخدم التدفق المناسب لإعداد سطح البيزو. احرص على إجراء أقصر اتصال ممكن مع البيزو لتجنب إزالة الاستقطاب حراريا. قم بتوصيل الشريحة بلوح التجارب السائل باستخدام تركيبات التثبيت.

أيضا ، قم بتوصيل مروحة تبريد باللوح لتنظيم درجة الحرارة أثناء التجارب الصوتية. بعد ذلك ، قم بربط الرقاقة بموصلات العالم. قم بتركيب اللوح على مرحلة المجهر وانضم إلى العالم لربط الموصلات بأنابيب إضافية عند المداخل والمنافذ.

باستخدام الربع القياسي 28 اتحادات ملولبة. بالنسبة لأنبوب واحد مقاس 16 بوصة ، قم بتوصيل شريحة الموائع الدقيقة بمضخة الحقنة ، وصمامات الاختيار متعددة المنافذ التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، وعدادات التدفق والأنابيب ذات الواجهة المدمجة للكمبيوتر كما هو موضح هنا والموضحة في الشكل الرابع من بروتوكول النص المصاحب. قبل تشغيل الفصل ، املأ خزانات كاشف التنظيف وقم بتجهيز خطوط السوائل المقابلة لها.

اضبط أيضا الصمامات الثالثة وأربعة عند منافذ الرقائق لتتدفق في البداية إلى خزانات النفايات. بعد ذلك ، قم بتشغيل مروحة التبريد. قم بتوصيل خيوط سيراميك البيزو بمكبر للصوت وضبط مولد الوظيفة على تردد الرنين للشريحة الصوتية المستخدمة.

اضبط نقطة ضبط الجهد على مولد الوظيفة بحيث يخرج مضخم التردد اللاسلكي بين 12 و 25 فولت ذروة إلى الذروة حسب الاقتضاء للفصل المطلوب. ثم قم بتوصيل قوارير التجميع المناسبة وقارورة إدخال المخزن المؤقت بالنظام. استخدم المخزن المؤقت للعينة المناسب للخلايا أو الجسيمات المراد فصلها أو كما هو مطلوب في مقايسة التحليل لاستخدامها بعد الفصل.

بعد ذلك ، قم بتحميل برنامج التحكم واستخدمه للتحكم في الصمامات وأجهزة استشعار التدفق والمضخة لتنفيذ روتين الفصل والفصل التلقائي بالكامل. مباشرة قبل البدء في إجراء الفصل ، قم بتدوير قارورة العينة لفترة وجيزة لإعادة تعليق أي جزيئات قد تكون قد استقرت. بدلا من ذلك، قم بتمرير العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات لخلط العينات البيولوجية الأكثر عرضة للتلف أو التكتل عن طريق الدوامة.

ثم قم بإرفاق قارورة العينة بخط الإدخال وابدأ روتين الفصل والفصل دون تأخير. ابدأ باستخدام البرنامج لإعداد مدخل الهواء للصمامين الأول والثاني للتأكد من أن الأنبوب لا يحتوي على سوائل. قم بتجهيز الأنبوب الذي يربط قارورة إدخال العازلة بالصمام الثاني وقارورة إدخال العينة بالصمام الأول.

اطلب من مضخة الحقنة سحب ما يقرب من 15 ميكرولترا من كلتا القارورتين لملء الأنبوب بالكامل ، وتوصيلها بالصمامات. أخيرا ، قم بتبديل الصمامين الأول والثاني للنفايات لطرد أي سائل أو هواء زائد دخل ملف التحميل. بعد ذلك ، قم بإعداد البرنامج لتحميل ملف العينة عن طريق سحب 25 ميكرولترا من الهواء أولا بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة.

ثم تحميل 250 ميكرولتر من العينة بمعدل 200 ميكرولتر في الدقيقة ، متبوعا ب 35 ميكرولترا من المخزن المؤقت الرئيسي بمعدل 200 ميكرولتر في الدقيقة ، وأخيرا ، 25 ميكرولترا أخرى من الهواء بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة. ثم اضبط مضخات الحقنة لبث سدادات السوائل المحملة بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة ومراقبة معدلات التدفق في منافذ الجسيمات الصغيرة والكبيرة باستخدام مستشعرات التدفق. يمكن تحديد نسبة التدفق المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

عندما تكتشف مستشعرات التدفق ارتفاعا في معدل التدفق يشير إلى مرور فجوة الهواء الأولى ، قم بتبديل صمام الإخراج المقابل من قارورة النفايات إلى قارورة جمع العينات. تأكد من أن التدفق مستقر أثناء عبور العينة للرقاقة ويتم فصله عن طريق مراقبة قراءات مستشعر التدفق. عندما تمر العينة عبر الرقاقة ، يتم جمع الكسور المنفصلة عند صمامات المخرج.

في نهاية قابس العينة ، راقب مستشعر التدفق ، واكتشف فجوة الهواء الثانية. في هذه المرحلة ، قم بتبديل صمامات الإخراج مرة أخرى إلى النفايات. بعد توزيع الحجم الكامل ، أوقف ضخ مضخة الحقنة وقم بإنهاء روتين الأتمتة.

بعد اكتمال تجربة الفصل ، افصل قوارير جمع عينات الجسيمات الصغيرة والكبيرة وقم بتخزينها بشكل مناسب للتحليل اللاحق. قم بتأمين أنبوب التقاط العينة في قوارير فارغة لجمع محاليل التنظيف الزائدة التي سيتم شطفها عبر الأنابيب. ثم ابدأ روتين التنظيف التلقائي للنظام كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

خلال هذه العملية ، سيتحكم البرنامج في الصمامات ومضخة الحقنة لتحميل ملف التثبيت بالتتابع بكواشف التنظيف وشطفها عبر النظام. بمجرد اكتمال عملية التنظيف وإزالة التلوث الآلي ، تخلص من محاليل التنظيف الزائدة والقوارير التي تم جمعها فيها باتباع الإجراءات المناسبة للتعامل مع النفايات البيولوجية أو الكيميائية. يظهر هنا مسح تردد تمثيلي من جهاز بيزو وميكروفلويديك مقترن جيدا.

عندما يكون الاقتران بين البيزو وجهاز الموائع الدقيقة جيدا ، تركز الجسيمات بإحكام عند تردد الرنين ، مما يؤدي إلى ذروة واضحة في شدة الفلورسنت والهجرة إلى موضع التركيز المتوقع. في المقابل ، عندما يكون هناك ضعف ، لن تركز جزيئات الاقتران بشكل جيد ويكون الجهاز غير مناسب عندما يكون التركيز عالي الجودة أو التدفق السريع أمرا بالغ الأهمية للتطبيق المطلوب. يمثل كل سطر في هذا الرسم البياني نتائج الفصل باستخدام أحجام مختلفة من جزيئات البوليسترين وفولتية قيادة البيزو.

بشكل عام ، هناك حاجة إلى جهد أعلى لاستخراج الجسيمات الأصغر. ومع ذلك ، لا يمكن زيادة الفولتية الجافة إلى أجل غير مسمى ، بسبب زيادة تبديد الحرارة وزيادة تأثيرات التدفق الصوتي. لإثبات فائدة هذه المنصة في فصل الجسيمات البيولوجية ، تم رفع خلايا الراجي البشرية التي يبلغ متوسط قطرها من ثمانية إلى 10 ميكرومتر بفيروس حمى الضنك الذي يبلغ قطره التقريبي 50 نانومتر ثم يتم فصله باستخدام جهاز الموائع الدقيقة الصوتية.

بمجرد تجميع نظام مثل هذا وبرمجته ، يمكن إجراء عمليات الفصل بشكل روتيني في غضون خمس دقائق تقريبا. يمكن معالجة حوالي ثلاث عينات في الساعة مع التنظيف الكامل وإزالة التلوث بين العينات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عد الخلايا أو النشاف الغربي أو تسلسل الجيل التالي من أجل تأكيد نقاء الفصل وتوضيح الأهمية البيولوجية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع جهاز فصل الموائع الدقيقة النموذجي. استخدم العالم لتقطيع الاتصالات للتفاعل مع الأجهزة وتشغيل إجراء فصل آلي بطريقة دقيقة وقوية. لا تنس أن العمل مع المواد المعدية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب أن يتم تنفيذه فقط من قبل موظفين مدربين تدريبا مناسبا باستخدام المعدات والإجراءات المناسبة الموصوفة مؤسسيا للسلامة البيولوجية.