A منصة ميكروفلويديك لتجهيز الدقة الصغيرة الحجم عينة واستخدامها لحجم الجسيمات البيولوجية منفصلة مع Microdevice الصوتية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء عمليات فصل مؤتمتة للجسيمات ذات الأحجام الصغيرة باستخدام جهاز ضوئي ميكروفلويدي. يمكن لهذه الطريقة تمكين إجراءات رئيسية في مجال الهندسة الطبية الحيوية، بما في ذلك المعالجة القوية وفصل العينات لتطبيقات الكشف الحيوي والأبحاث السريرية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الوحدوية والدقة والمتانة والأتمتة، مما يجعلها قابلة للتكيف والمرونة ليس فقط لفصل الشبكات، بل لمجموعة واسعة من أجهزة الفصل الميكروفلويدية ذات التدفق المستمر.

أدركنا أولاً الحاجة إلى هذه القدرة لإجراء عمليات فصل روتينية وموثوقة على أحجام عينات بيولوجية تقل عن المليمتر دون حدوث تخفيف كبير أو فقدان في المادة المراد تحليلها. ويعد دمج قياس العينة والتوجيه الآلي من المصدر إلى ملفات التجميع، جنباً إلى جنب مع عمليات مضخة الحقنة القياسية، أمراً بالغ الأهمية للعمل بنجاح بهذا المقياس. لبدء التصميم، قم بتصميم جهاز الشبكة الصوتية ومخطط القناعين الفوتوغرافيين كما هو موضح في القسم الأول من البروتوكول النصي المصاحب.

بعد ذلك، قم بتشكيل نمط منافذ السوائل الخلفية على رقاقة سيليكون 1 0 0 مصقولة من الجانبين. وباستخدام تقنية الطباعة الحجرية الضوئية القياسية للمقاوم الموجب، قم بنقش هذه الهندسة باستخدام النقش الأيوني التفاعلي العميق إلى عمق يتراوح من 350 إلى 400 micrometers. بعد ذلك، اقلب الرقاقة وقم بتشكيل نمط هندسة قناة السوائل في الجانب الأمامي.

مرة أخرى، باستخدام تقنية الليثوغرافيا الضوئية التقليدية للمقاوم الموجب، يتم تثبيت الرقاقة المنقوشة على رقاقة حاملة ثانية من السيليكون الفارغ. باستخدام المقاوم الضوئي، يتم الآن نقش القنوات المكشوفة وصولاً إلى عمق 200 micrometers. وباستخدام تقنية النقش الأيوني العميق، يتم بعد ذلك نقع رقاقة الجهاز في محلول لإزالة المقاوم لفصلها عن رقاقة السيليكون الفارغة.

بعد ذلك، قم بتنظيف رقاقة الجهاز ورقاقة زجاج البوروسيليكات الملساء بسمك 0.5 millimeter باستخدام محلول البيرانا. وبمجرد التنظيف، قم بإحكام غلق القنوات السائلة عن طريق الربط الأيوني بين رقاقة الزجاج ورقاقة السيليكون باستخدام الظروف الموضحة هنا. وأخيرًا، قم بقطع الرقائق الفردية باستخدام شفرة ماسية على منشار التقطيع من طقم إيبوكسي منخفض اللزوجة مكون من عنصرين.

قم بوزن المكونين وفقاً للنسبة الموصى بها وامزجهما جيداً. بعد ذلك، ضع سيراميك الـ piezo من نوع lead Zirkin eight titanate أو PCT في قالب تثبيت مناسب، واستخدم ماصة لتوزيع حوالي 10 µL من خليط الإيبوكسي بالتساوي فوقه لتكوين طبقة رقيقة ومتجانسة. ثم، ضع الشريحة في قالب التثبيت وقم بمحاذاة جانب الإيبوكسي من سيراميك الـ pizo مع الشريحة الموائعية الدقيقة.

قد يكون من الضروري تثبيت الشريحة باستخدام شريط لاصق لإبقائها في مكانها أثناء عملية المحاذاة. قم بتثبيت المجموعة في ملزمة مع الحرص على عدم كسر أي من المكونات، ثم قم بالمعالجة وفقاً لدرجة الحرارة والمدة الموصى بهما من قبل الشركة المصنعة للإيبوكسي. بعد جفاف الإيبوكسي، استخدم مكواة لحام ذات رأس دقيق لتوصيل أسلاك توصيل رفيعة بكل جانب من جوانب السيراميك الكهرضغطية (pizo ceramic).

استخدم مساعد اللحام (flux) المناسب لتجهيز سطح الـ pizo إذا لزم الأمر. احرص على أن يكون التلامس مع الـ pizo في أقصر وقت ممكن لتجنب إزالة استقطابه حرارياً. قم بتثبيت الشريحة على لوحة تجارب مائعية (fluidic breadboard) باستخدام أدوات التثبيت.

بالإضافة إلى ذلك، قم بتوصيل مروحة تبريد بلوحة التجارب (breadboard) لتنظيم درجة الحرارة أثناء التجارب الصوتية. بعد ذلك، قم بتثبيت الشريحة في موصلات العالم (world connectors) باستخدام البراغي. قم بتركيب لوحة التجارب على منصة المجهر، وقم بتوصيل موصلات العالم بالشريحة بأنابيب إضافية عند المداخل والمخارج.

باستخدام وصلات مسننة قياسية مقاس ربع بوصة (quarter 28). وبالنسبة للأنابيب ذات القطر 1/16 بوصة، يتم توصيل الشريحة الموائعية الدقيقة بمضخة الحقنة، وصمامات الاختيار متعددة المنافذ التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر، ومقاييس التدفق المتصلة بجهاز الكمبيوتر والأنابيب كما هو موضح هنا وموصوف في الشكل 4 من البروتوكول النصي المرفق. وقبل البدء في عملية الفصل، يتم ملء خزانات كاشف التنظيف وتحضير خطوط السوائل المقابلة لها.

قم أيضاً بضبط الصمامين الثالث والرابع عند مخارج الشريحة ليكون التدفق في البداية باتجاه خزانات النفايات. بعد ذلك، قم بتشغيل مروحة التبريد. صِل أسلاك السيراميك الكهرضغطية بمضخم الطاقة، واضبط مولد الدوال على التردد الرنيني الخاص بالشريحة الصوتية المستخدمة.

اضبط نقطة ضبط الجهد في مولد الدوال بحيث يخرج مضخم الترددات الراديوية (RF amplifier) جهداً يتراوح بين 12 و 25 فولت من القمة إلى القمة (volts peak to peak)، وفقاً لما يتطلبه الفصل المنشود. بعد ذلك، قم بتوصيل قوارير الجمع المناسبة وقارورة إدخال المحلول المنظم بالنظام. استخدم المحلول المنظم للعينات المناسب للخلايا أو الجسيمات المراد فصلها، أو حسبما يتطلبه تحليل المقايسة الذي سيتم استخدامه بعد عملية الفصل.

بعد ذلك، قم بتحميل برنامج التحكم واستخدمه للتحكم في الصمامات ومستشعرات التدفق والمضخة لتنفيذ إجراء التحضير والفصل الآلي بالكامل. وقبل البدء في إجراء الفصل مباشرةً، قم برج أنبوبة العينة باستخدام جهاز الرج (vortex) لفترة وجيزة لإعادة تعليق أي جزيئات قد تكون قد ترسبت. وبدلاً من ذلك، استخدم الماصة لسحب العينة ودفعها لأعلى وأسفل 10 مرات لخلط العينات البيولوجية الأكثر عرضة للتلف أو التكتل نتيجة الرج.

بعد ذلك، قم بتوصيل قارورة العينة بخط الإدخال وابدأ في روتين التجهيز والفصل دون تأخير. ابدأ باستخدام البرنامج لتجهيز مدخل الهواء في الصمامين الأول والثاني للتأكد من خلو الأنابيب من أي سائل. وفي الوقت ذاته، قم بتجهيز الأنابيب التي تربط قارورة إدخال المنظم بالصمام الثاني وقارورة إدخال العينة بالصمام الأول.

اجعل مضخة الحقنة تسحب حوالي 15 µL من كلا القارورتين لملء الأنابيب بالكامل، وربطهما بالصمامات. وأخيراً، قم بتحويل الصمامين الأول والثاني إلى مسار النفايات لطرد أي سائل زائد أو هواء قد دخل إلى ملف التحميل. بعد ذلك، قم بإعداد البرنامج لتحميل ملف العينة عن طريق سحب 25 µL من الهواء أولاً بمعدل 50 µL/min.

ثم يتم تحميل 250 microliters من العينة بمعدل 200 microliters في الدقيقة، يليه 35 microliters من المحلول المنظم الرائد بمعدل 200 microliters في الدقيقة، وأخيرًا، 25 microliters أخرى من الهواء بمعدل 50 microliters في الدقيقة. بعد ذلك، تُضبط مضخات المحاقن لضخ سدادات السوائل المحملة بمعدل 100 microliters في الدقيقة، ومراقبة معدلات التدفق عند مخارج الجسيمات الصغيرة والكبيرة باستخدام مستشعرات التدفق. يمكن تحديد نسبة التدفق المناسبة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

عندما ترصد مستشعرات التدفق ارتفاعاً مفاجئاً في معدل التدفق يشير إلى مرور الفجوة الهوائية الأولى، قم بتحويل صمام المخرج المقابل من قارورة النفايات إلى قارورة تجميع العينات. تأكد من استقرار التدفق أثناء انتقال العينة عبر الشريحة وفصلها من خلال مراقبة قراءات مستشعرات التدفق. ومع مرور العينة عبر الشريحة، يتم تجميع الأجزاء المفصولة عند صمامات المخرج.

عند نهاية سدادة العينة، راقب مستشعر التدفق، وحدد الفجوة الهوائية الثانية. عند هذه النقطة، أعد تحويل صمامات المخرج إلى النفايات. بعد صرف الحجم الكامل، أوقف ضخ المضخة المحقنة وأنهِ روتين الأتمتة.

بعد اكتمال تجربة الفصل، افصل قوارير تجميع عينات الجسيمات الصغيرة والكبيرة وخزنها بشكل مناسب لإجراء التحليلات اللاحقة. قم بتثبيت أنبوب سحب العينات في قوارير فارغة لتجميع محاليل التنظيف الزائدة التي سيتم دفعها عبر الأنابيب. بعد ذلك، ابدأ روتين تنظيف النظام الآلي كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

خلال هذه العملية، سيقوم البرنامج بالتحكم في الصمامات ومضخة المحقنة لتحميل ملف الاحتجاز بتتابع بعوامل تنظيف ثم دفعها عبر النظام. وبمجرد اكتمال عملية التنظيف وإزالة التلوث الآلية، تخلص من محاليل الشطف الزائدة والقوارير التي جُمعت فيها باتباع الإجراءات المناسبة للتعامل مع النفايات البيولوجية أو الكيميائية. يظهر هنا مسح ترددي نموذجي لجهاز piezo وجهاز مائع ميكروي (microfluidic) متصلين بشكل جيد.

عندما يكون الاقتران بين جهاز البيزو (pizo) والجهاز الموائع الدقيقة (microfluidic device) جيداً، تتركز الجسيمات بشكل وثيق عند تردد الرنين، مما يؤدي إلى ظهور قمة واضحة في شدة الفلورة والانتقال إلى موضع التركيز المتوقع. وفي المقابل، في حالات الاقتران الضعيف، لن تتركز الجسيمات بشكل جيد، ويكون الجهاز غير مناسب عندما يكون التركيز عالي الجودة أو التدفق السريع أمراً حاسماً للتطبيق المطلوب. يمثل كل خط في هذا الرسم البياني نتائج الفصل باستخدام أحجام مختلفة من جسيمات البولي ستيرين وجهود تشغيل مختلفة لجهاز البيزو.

بشكل عام، تتطلب استخلاص الجسيمات الأصغر أحجاماً أعلى من الجهد الكهربائي. ومع ذلك، لا يمكن زيادة الجهود الجافة إلى ما لا نهاية، وذلك بسبب زيادة تبدد الحرارة وتصاعد تأثيرات التدفق الصوتي. ولإثبات فائدة هذه المنصة في فصل الجسيمات البيولوجية، تم تطعيم خلايا راجي البشرية، التي يتراوح متوسط قطرها بين 8 إلى 10 µm، بفيروس dengue الذي يبلغ قطره التقريبي 50 nm، ثم فُصلت باستخدام جهاز الموائع الدقيقة الصوتي.

بمجرد تجميع نظام كهذا وبرمجته، يمكن إجراء عمليات الفصل بشكل روتيني في غضون خمس دقائق تقريبًا. كما يمكن معالجة حوالي ثلاث عينات في الساعة مع إجراء تنظيف وتطهير كاملين بين العينات. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عد الخلايا، أو لطخة ويسترن (western blotting)، أو تسلسل الجيل القادم (next generation sequencing) وذلك من أجل تأكيد نقاء الفصل وتوضيح الأهمية البيولوجية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تصنيع جهاز فصل ميكروفلويديك (microfluidic) نموذجي. واستخدام وصلات "العالم إلى الرقاقة" (world to chip) للربط مع الأجهزة وتشغيل إجراء فصل مؤتمت بطريقة دقيقة وقوية. لا تنسَ أن التعامل مع المواد المعدية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب ألا يتم ذلك إلا بواسطة أفراد مدربين تدريباً مناسباً، وباستخدام المعدات والإجراءات المقررة مؤسسياً للسلامة البيولوجية.