سريع المعالجة الأنزيمية من البروتينات للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد مع Microreactor التدفق من خلال

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف تصنيع مفاعل ميركور تظليبي متدفق يقوم بعملية هضم إنزيمي سريع للبروتينات لتمكين تحديد البروتين باستخدام مطياف كتلة التأين بالرش الكهربائي. يمكن أن تساعد الطريقة في توضيح تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات المعزولة والنقية لدعم التوصيف النهائي للبنية والوظيفة. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه سريع وفعال من حيث التكلفة وعرضة للتكامل في مهام سير العمل التي تستخدم الأنظمة الأساسية المصنوعة من الدقيقة.

للبدء ، استخدم الساطور الشعري الزجاجي لقطع الأنبوب الشعري الزجاجي الأكبر بطول سبعة إلى ثمانية سنتيمترات ، والأصغر بطول ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات. استخدم مجهرا للتحقق من أن كلا الطرفين الشعريين لهما قطع نظيف ومستقيم ، دون أي نتوءات بارزة. أدخل الشعيرات الدموية الأصغر حوالي ستة ملليمترات في أحد طرفي الطرف الأكبر.

بعد ذلك ، استخدم طرف Q لتطبيق قطرة صغيرة من الغراء حول تقاطع الشعيرات الدموية ، واترك الغراء يشفى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بقص الشعيرات الدموية التي تم إدخالها بطول حوالي 10 إلى 15 ملم. ستعمل هذه النهاية كباعث تأين بالرش الكهربائي.

أدخل الطرف المقابل للشعرية ذات القطر الأكبر في أنبوب PEEK مقاس 1/32 بوصة تم قطعه مسبقا يتراوح طوله بين أربعة وخمسة سنتيمترات ومتصل باتحاد PEEK. بعد ذلك ، أدخل وشد القطعة التي يبلغ طولها خمسة سنتيمترات من أنبوب PTFE 1/16 في الطرف المقابل للاتحاد. في ملف زجاجي نظيف وجاف سعة ملليلترين ، قم بوزن أربعة ملليغرامات من جزيئات C18 ثم أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول.

أغلق القارورة. ضعه في حمام الموجات فوق الصوتية وصوتنة لتفريق الجسيمات بالتساوي في المحلول. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 250 ميكرولتر لسحب 200 ميكرولتر من الملاط C18.

أدخل المحقنة في أنبوب PTFE مقاس 1/16 بوصة وقم بتوزيع الملاط ببطء في الشعيرات الدموية الكبيرة. راقب تحت المجهر بينما تمتلئ الشعيرات الدموية بالجسيمات ، حتى يتم تحقيق ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من تعبئة الجسيمات. يحتفظ الأنبوب الشعري الأصغر بهذه الجسيمات في المفاعل الدقيق من خلال تأثير حجر الزاوية.

أخيرا ، اشطف المفاعل الدقيق ب 50 ميكرولترا من محلول 50 إلى 50 من الماء والأسيتونيتريل ، متبوعا ب 50 ميكرولترا من محلول يحتوي على 49 ميكرولتر من الماء ، ممزوجا بميكرولتر واحد من الأسيتونيتريل. افصل المفاعل الدقيق الشعري عن اتحاد PEEK وقم بتوصيله بنظرة خاطفة-T. بعد ذلك ، أدخل سلكا بلاتينا بطول سنتيمترين ، معزولا بغطاء PEEK مقاس 1/32 بوصة لتوفير اتصال خال من التسرب في الذراع الجانبي ل PEEK-T.

قم بتوصيل الشعيرات الدموية لنقل العينة بطول نصف متر بالطرف المقابل من PEEK-T. استخدم غلاف PEEK مقاس 1/32 بوصة لتوفير اتصال خال من التسرب. قم بتأمين نظرة خاطفة على مرحلة XYZ.

ووضع باعث التأين بالرش الكهربائي على بعد ملليمترين تقريبا من الشعيرات الدموية لمدخل مطياف الكتلة. بعد ذلك ، قم بتوصيل السلك البلاتيني بمصدر مصدر طاقة التأين بالرش الكهربائي لمطياف الكتلة. أيضا ، قم بتوصيل الطرف المقابل من الشعيرات الدموية لنقل العينة باتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ ، باستخدام غلاف PEEK مقاس 1/16 بوصة لتوفير اتصال خال من التسرب.

بعد ذلك ، قم بتوصيل قطعة بطول أربعة إلى خمسة سنتيمترات من أنابيب PTFE بطول 1/16 بوصة بالطرف المقابل لاتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. أدخل معلمات الحصول على بيانات MS الترادفية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب في حزمة البرامج التي تتحكم في أداة MS. احفظها كملف أسلوب لتجهيز الإعداد لإجراء التحليل.

تم تجهيز نظام LTQ MS بمصدر ESI معدل يتضمن مرحلة XYZ محلية الصنع ، والتي تتيح ربط مطياف الكتلة بأساليب إدخال العينة المختلفة. قم بتحميل حقنة سعة 250 ميكرولتر بمحلول مائي من 50 ملي مولار بيكربونات مذاب في 2٪ من الأسيتونيتريل. ثم قم بتوصيل المحقنة بالمفاعل الصغير ، وضعها تحت مضخة المحقنة.

اشطف المفاعل الدقيق وميكرولترين في الدقيقة لمدة خمس دقائق لإعداده للتحليل. بعد ذلك ، قم بتحميل عينة البروتين محل الاهتمام في حقنة سعة 250 ميكرولتر وقم بنقع محلول العينة بمعدل ميكرولتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع حقنة سعة 250 ميكرولتر محملة بمحلول التربسين بخمسة ميكرومولار أسفل مضخة الحقنة ، وقم بنقع البروتين الممتص على المفاعل الدقيق بمعدل ميكرولتر في الدقيقة لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق.

من الأهمية بمكان أن يذوب المرء حديثا ويحضر محلول التربسين قبل كل تجربة. سيضمن ذلك احتفاظ الإنزيم المحلل الأولي بنشاطه ودرجة الحموضة التشغيلية للمفاعل الدقيق ، وهو درجة حموضة تبلغ حوالي 8. قم بتحميل حقنة أخرى سعة 250 ميكرولتر بمحلول مائي يتكون من 0٪ 1٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك مضاف إلى 2٪ أسيتونيتريل.

استخدم هذا المحلول لإخماد عملية الهضم المحلل للبروتين عن طريق شطف المفاعل الدقيق بمعدل ميكرولتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى حقنة مملوءة بحمض ثلاثي فلورو أسيتيك 01٪ مضاف إلى 50٪ أسيتونيتريل ، وقم بتشغيل عملية الحصول على بيانات MS في جهد التأين بالرش الكهربائي إلى حوالي 2000 فولت. استخدم المحلول المحمض لبدء هضم البروتين من المفاعل الدقيق بمعدل 300 نانولتر في الدقيقة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

الحصول على بيانات المواصفات الجماعية باستخدام معلمات الحصول على البيانات المتوفرة في بروتوكول النص المصاحب. قم بمعالجة ملفات LTQ MS الأولية باستخدام قاعدة بيانات بروتين زائدة عن الحاجة عن طريق تحميل البيانات الأولية أولا في محرك البحث. بعد ذلك ، اضبط تفاوتات كتلة الأيونات الأصلية والشظية على اثنين وواحد من الدالتون على التوالي ، واستخدم فقط شظايا تربتية كاملة مع ما يصل إلى انقسامين فائتهما للبحث.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين معدلات الاكتشاف الخاطئ عالية ومتوسطة الثقة على 1٪ و 3٪ على التوالي ، ولا تسمح بتعديلات ما بعد الترجمة ، ما لم تبحث على وجه التحديد عن تعديلات معينة. أخيرا ، قم بتصفية البيانات لتحديد تطابقات الببتيد عالية الثقة فقط. يظهر هنا طيف كتلي يتكون من الببتيدات التربتية التي تم إنشاؤها من خليط بروتيني تعرض للتحلل البروتيني في المفاعل الدقيق.

تمثل هذه الملصقات أيونات الببتيد التربتية الأكثر كثافة وتوفر تسلسلها ومعرف البروتين المقابل. يوفر هذا المفاعل الدقيق تجربة سهلة التنفيذ تم إعدادها لإجراء الهضم الأنزيمي للبروتينات ويتيح تحليل الكتلة وتحديدها في أقل من 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحفاظ على نظافة القوارير والأجهزة التي تتلامس مع المحاليل أمر بالغ الأهمية لتجنب تلوث العينة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى للحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي لتمكين توصيف أفضل للببتيدات التوليدية والإجابة على أسئلة إضافية تتعلق ببنية البروتينات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البروتينات لتطوير بروتوكولات أسرع لتحليل البروتينات واستكشاف تطوير منصات دقيقة جديدة تتيح استكشاف العينات البيولوجية عالية الإنتاجية. تقتصر هذه التقنية على تحليل مخاليط البروتين البسيطة إلى حد ما التي تولد 25 إلى 50 ببتيد.

يمكن تحليل هذه الببتيدات عن طريق تجارب التسريب البسيطة ولا تتطلب فصل الكروماتوجرافية السائلة قبل تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. لا تنس أن العمل مع المذيبات العضوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل تجنب اللهب المكشوف أثناء تنفيذ هذا الإجراء.