العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

الهدف العام من هذا الفيديو هو وصف كيفية تحضير وسط مكيف للعظام ، واختبار نشاطه في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد رقائق العظام أولا من الفك السفلي للخنزير باستخدام مكشطة العظام. الخطوة الثانية هي المعالجة الحرارية أو إزالة المعادن أو عدم فعل أي شيء لرقائق العظام قبل احتضانها في وسط الاستزراع لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، يتم جمع الوسط المكيف للعظام الذي يحتوي على جميع العوامل المنبعثة من رقائق العظام. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحفيز الخلايا ذات الوسط المكيف للعظام أو احتضان مادة حيوية مسبقا مع الوسط المكيف للعظام وخلايا البذور عليها بعد فترة الحضانة. في النهاية ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي لإظهار التغييرات في التعبير الجيني للخلايا بعد العلاج.

يحفز استخدام ترقيع العظام الذاتية بمفردها أو بالاشتراك مع مواد حيوية أخرى تجديد العظام في عيوب العظام المحيطة بالزرع، وبالتالي يضمن نتائج جيدة على المدى الطويل. يقدم هذا الفيديو اختبارا حيويا في المختبر ، وهو مفيد في تحديد الاستجابة الجينية للخلايا الكتلية للجزيئات الحيوية داخل حالة العظام. يمكن أن يساعد وسط حالة العظام المتوسطة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الصدمات والوجه والفكين والأسنان ، مثل سبب كون العظم الذاتي هو هدف الكسب غير المشروع القياسي في تجديد العظام.

يكون من الصعب توحيد وسط الحالة من العظام المعالجة ، مثل الطعم التلقائي للعظام المعالجة حراريا أو مصفوفة العظام. لذلك ، من المهم أن تكون دقيقا. للبدء ، احصل على الفك السفلي الطازج للخنازير من جزار محلي ووضعها على سطح صلب.

بعد ذلك ، استخدم السمحاق لتحرير سديلة كاملة السمحاق مع إيلاء اهتمام خاص لعدم ترك أي من الأنسجة الرخوة متصلة بالعظام. بمجرد إزالة السمحاق ، أمسك مكشطة العظام بإحكام واستخدم حركات طويلة لحصاد رقائق العظام من الجانب الشدقي من الفك السفلي. تخلص من أي من رقائق العظام التي يقل طولها عن ملليمتر واحد.

امنع رقائق العظام من الجفاف عن طريق تغطيتها بسرعة بوسط استزراع في طبق بتري بطول 10 سم. بعد جمع ما يكفي من رقائق العظام ، قم بإعداد دفعة تحكم حراري عن طريق بسترة خمسة جرامات من رقائق العظام. قم ببسترة الرقائق عن طريق تسخينها لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية أو الأوتوكلافها لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإعداد عنصر تحكم منزوع المعادن عن طريق إضافة خمسة جرامات من رقائق العظام في محلول مولاري واحد من حمض الهيدروكلوريك ووضعها على شاكر لمدة أربع إلى ست ساعات عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل رقائق العظام بشكل متكرر بوسط الثقافة حتى يصل إلى درجة حموضة محايدة. ضع خمسة جرامات من رقائق العظام الطازجة وخمسة جرامات من كل من مستحضرات التحكم في أطباق منفصلة ، وأضف 10 مل من وسط الثقافة الطازجة إلى كل طبق.

ثم احتضان العينات في جو مرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة من أجل إنشاء الوسط المكيف في اليوم التالي. قم بإزالة الوسائط من كل طبق وضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للوسائط المكيفة للعظام عند 200 مرة من الجاذبية لمدة 10 دقائق لإزالة أي حطام.

ثم قم بإزالة المادة الطافية وقم بتمريرها عبر فلتر معقم 0.2 ميكرون ، وقم بتخزين كواد علي المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها. ابدأ بزرع الخلايا الوسيطة البشرية مثل خلايا العظام أو الخلايا الليفية في الأربطة اللثية واللثة في صفيحة حوت 12 بتركيز 30،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. قم بتغطية الخلايا بوسط النمو واترك الخلايا تلتصق باللوحة طوال الليل في صباح اليوم التالي.

تخلص من وسط الثقافة واغسل الخلايا باستخدام PBS الدافئ عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتحفيز الخلايا عن طريق إضافة وسط مزرعة خالية من المصل قبل التدفئة مع وبدون 20٪ وسط مكيف للعظام. إذا كنت تختبر أيضا قدرة امتصاص المادة الحيوية ، فأضف الوسط المكيف للعظام ، بما في ذلك أي عناصر تحكم في الأنابيب التي تحتوي على المادة الحيوية ذات الأهمية ، واحتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثم شطف المادة الحيوية بقوة مع PBS prewarm وبذور الخلايا الوسيطة البشرية بتركيز 30،000 خلية لكل سنتيمتر مربع على المادة. احتضان الخلايا بمفردها أو تلك المصنفة على المواد الحيوية في جو مرطب عند 37 درجة خلايا CS لمدة 24 ساعة. ثم تجاهل وسيط الثقافة.

اشطف الخلايا باستخدام PBS الدافئ واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا باستخدام بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي القياسي. بمجرد عزل الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد عينات CD NA لكل مجموعة معالجة من خلال البدء بتركيزات متساوية من الحمض النووي الريبي المستخرج وتشغيل تفاعل نسخ عكسي على كل عينة. ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي على العينات للبحث عن مستويات الجينات المختارة باستخدام البادئات والشروط المدرجة في بروتوكول النص المصاحب.

أخيرا ، احسب جودة الوسط المكيف للعظام بناء على مستويات التعبير الجيني النسبي عن طريق التطبيع إلى مستويات عتبة دورة الجينات إلى جين التدبير المنزلي Gabb dh باستخدام طريقة دلتا دلتا التصوير المقطعي المحوسب. فيما يلي بعض النتائج النموذجية التي توضح التغيرات في التعبير الجيني للأرومات الليفية الفموية المعرضة لوسط مكيف للعظام لمدة 24 ساعة. تم تنظيم جينين هما الأدرينالين وبنت تراكس وثلاثة بشكل كبير إلى 40٪ من المستويات الأصلية ، في حين أن الإنترلوكينات 11 و 33 ، جنبا إلى جنب مع N-A-D-P-H أوكسيديز أربعة والبروتين جليكان أربعة تم تنظيمهما جميعا بقدر 200 ضعف.

ومن المثير للاهتمام أن أغشية حاجز الكولاجين المستخدمة لحماية رقائق العظام من الأنسجة الرخوة المحيطة تمتص الكثير من الوسط المكيف للعظام المسؤول عن التغيرات في التعبير الجيني. ومع ذلك ، فشلت أغشية الكولاجين في امتصاص العوامل التي تتحكم في تعبير الإنترلوكين 33. لذلك ، لا يتم تنظيم تعبير إنترلوكين 33 في هذا الإعداد.

يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لدراسة استجابة أنواع مختلفة من الخلايا التي تنطوي على تجديد العظام. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لتحضير وسط الحالة من عظام العملية وحشوات العظام الأخرى. لا تزال الأهمية السريرية لهذا الاختبار الحيوي غير واضحة.

المحتمل أن تكون الاستجابة الخلوية ل BCM في الجسم الحي أكثر تعقيدا وتتضمن مجموعة كبيرة من الجينات والخلايا المستهدفة المختلفة التي تمتد إلى تلك المعروضة هنا. ومع ذلك ، فإن مقايسنا الحيوية توفر رؤى أولى حول التركيب المعقد المفترض لجزيئات سلاح الجو الملكي البريطاني للعظام والاستجابة الخلوية في المختبر.