ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية تصنيع وتشغيل شريحة مائعية دقيقة، والتي تتيح عزل واستزراع الخلايا المفردة بكفاءة عالية. وتوفر هذه الطريقة أداة مفيدة لأي مجال يمكن أن يستفيد من عزل واستزراع الخلايا المفردة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كفاءتها العالية في تحميل الخلايا المفردة داخل مصفوفات كبيرة من الآبار الدقيقة.

علاوة على ذلك، يتم استخدام التدفق اللطيف وقوة الجاذبية فقط لتشغيل الجهاز، مما يقلل من تلف الخلايا. وتتجه تطبيقات هذه التقنية نحو التشخيص النهائي للأمراض البشرية مثل السرطان، حيث يؤثر التباين الخلوي على استجابة الخلايا؛ لذا فقد خطرت لنا فكرة تطوير هذه الطريقة أثناء تأسيسنا لخط خلوي في الآبار الدقيقة، لأن طريقة التخفيف المحدود كانت تستغرق وقتاً طويلاً للغاية وغير فعالة. والآن، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى معمقة حول تحليل الخلايا الفردية.

كما يمكن تطبيق هذه الطريقة في تطبيقات أخرى مثل إنشاء ومراقبة المسار والسلوك الفردي للخلايا بمرور الوقت. للبدء، قم بتصنيع قوالب رئيسية مُسيلنة (silanized) لكل من طبقة عزل الخلايا المفردة وطبقة استنبات الآبار الدقيقة، باستخدام تقنية الطباعة الحجرية الضوئية القياسية كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. لكل قالب رئيسي، اخلط 16 grams من قاعدة PDMS مع 1.6 grams من عامل المعالجة في كوب قابل للتخلص منه، وحرك الخليطين حتى يتجانسا.

بعد ذلك، ضع القوالب الرئيسية في أطباق بتري بقطر 150 millimeter، ثم صب الـ PDMS فوق القوالب. ضع أطباق بتري في مجفف (desiccator) وطبق تفريغاً هوائياً لمدة ساعة واحدة لإزالة الفقاعات الهوائية من الـ PDMS. وبعد مرور ساعة واحدة، أخرج الأطباق من المجفف وضعها في فرن تقليدي عند درجة حرارة 65 degrees Celsius لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات لمعالجة الـ PDMS.

بعد ذلك، أخرج الأطباق من الفرن واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. وبمجرد أن تبرد، قم بتقشير مصفوفة آبار الالتقاط ومصفوفة زراعة الآبار الدقيقة المصنوعة من PDMS والمعالجة حرارياً عن القوالب الرئيسية، ثم قم بقص الأجهزة باستخدام شفرة حلاقة. بعد ذلك، استخدم خرامة بقطر 0.75 millimeter لعمل ثقب واحد عند كل طرف من طرفي القناة الدقيقة في طبقة مصفوفة آبار الالتقاط.

استخدم شريطاً لاصقاً لتنظيف ما سيصبح السطح الداخلي للجهاز، ثم ضع الطبقات الفردية بحيث تكون الأسطح الداخلية متجهة للأعلى في جهاز تنظيف بالبلازما لإجراء معالجة قصيرة ببلازما الأكسجين. عند الانتهاء، أخرج طبقات PDMS من جهاز التنظيف بالبلازما واستخدم مجهراً ستيريو لمحاذاة وربط الطبقتين العلوية والسفلية للجهاز. ضع الجهاز بعد محاذاته في فرن عند 65 درجة Celsius لمدة 24 ساعة لإنشاء رابطة دائمة بين طبقات PDMS.

بعد ذلك، ضع جهاز PDMS المرتبط في ماء منزوع الأيونات، ثم ضع الوعاء في مجفف تحت تفريغ هوائي لمدة 15 دقيقة، وذلك لإزالة الهواء من القناة الدقيقة للجهاز. بعد إزالة كافة الهواء من الجهاز، ضع جهاز PDMS في غطاء زراعة الأنسجة واستخدم الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم سطح الجهاز لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، استبدل الماء منزوع الأيونات في الجهاز بمحلول 5% bovine serum albumin في PBS، ثم قم بحضن الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

سيعمل ذلك على سد السطح وتحسين كفاءة نقل الخلايا المعزولة من آبار الالتقاط إلى آبار الزرع. بعد 30 دقيقة، استبدل محلول السد في الجهاز بمحلول PBS معقم. قم بتحضير معلق من الخلايا المفردة بتركيز 2.5 مليون خلية لكل مليلتر، ثم املأ ماصة بـ 50 µL من المعلق.

بعد ذلك، انقل الخلايا إلى الجهاز عبر فتحة المخرج الخاصة به. قم بتحميل 50 microliters أخرى من معلق الخلايا وانقلها إلى الجهاز عبر فتحة المدخل لملء القناة الدقيقة بأكملها بالخلايا بشكل متساوٍ. وبمجرد التحميل، استخدم سدادة معقمة مصنوعة من خيط صيد من النايلون بقطر واحد millimeter لسد فتحة المخرج في الجهاز.

بعد ذلك، املأ محقنة معقمة سعة 1 mL بوسط استنبات، وقم بتفريغ أي فقاعات هواء متبقية، ثم ضعها في مضخة المحقنة. قم بتوصيل إبرة غير مدببة قياس 23 gauge بالمحقنة، واستخدم أنابيب polytetrafluoroethylene لتوصيل الإبرة بمدخل الجهاز. بعد توصيل الأنبوب، قم بإزالة السدادة من فتحة المخرج وانتظر لمدة دقيقتين حتى تستقر الخلايا في آبار التقاط الخلية الواحدة بفعل قوة الجاذبية.

بعد ذلك، اضبط مضخة السرنجة على 600 microliters في الدقيقة. قم بإزالة سدادة المخرج واغسل الخلايا غير الملتصقة لمدة 30 ثانية. انتظر دقيقتين حتى يستقر الضغط.

بعد ذلك، قم بإزالة الأنبوب من مدخل الجهاز وسد فتحتي المدخل والمخرج باستخدام سدادات لتشكيل نظام استزراع مغلق. الآن، اقلب الجهاز يدويًا لنقل الخلايا المفردة التي تم التقاطها إلى آبار الاستزراع الدقيقة الموجودة على الجانب الآخر من الجهاز. ثم ضع الجهاز في طبق استزراع أنسجة بقطر 100 millimeter، وأضف 10 milliliters من PBS المعقم حول الجهاز، وضع الطبق في الحاضنة.

لاستبدال وسط الاستنبات، ضع أولاً قطرتين من وسط الاستنبات فوق جهاز PDMS بالقرب من المدخل والمخرج لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى القناة الدقيقة. بعد ذلك، استخدم خرامة خزعة بقطر 0.75 millimeter لعمل ثقبين من أعلى جهاز PDMS بالقرب من نهايتي القناة الدقيقة. تأكد من ثقب الطبقة العلوية من الجهاز فقط.

بعد ذلك، املأ حقنة بلاستيكية سعة 1 مل تحتوي على وسط غذائي طازج ومسخن مسبقاً، واستخدم إبرة غير مدببة بقياس 23 gauge وأنبوب PTFE لتوصيلها بفتحة المدخل التي تم إنشاؤها حديثاً. قم بتدفيق ما يقرب من 120 µL من الوسط الغذائي الطازج ببطء داخل الجهاز على مدار خمس دقائق لاستبدال الوسط القديم. عند الانتهاء، أحكم إغلاق فتحتي المدخل والمخرج باستخدام سدادتين، ثم أعد الجهاز إلى حاضنة زراعة الخلايا.

تتراوح نسبة الخلايا التي تستقر في آبار الالتقاط بين 68% و 85% تقريبًا، وذلك اعتمادًا على نوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي معظم آبار الالتقاط على خلية واحدة فقط لجميع أنواع الخلايا الثلاثة. وبعد نقل خلايا KT98 التي تم التقاطها إلى آبار الزرع، تبين أن حوالي 77% من الآبار احتوت على خلية واحدة فقط، و 16% لم تحتوي على أي خلايا، و 6% احتوت على خليتين، بينما احتوت أقل من 1% من الآبار على ثلاث خلايا أو أكثر.

على مدار سبعة أيام، أظهرت الخلايا المفردة المعزولة أنماط نمو غير متجانسة؛ فبينما تضاعفت بعض الخلايا، لم تتضاعف خلايا أخرى. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 20 دقيقة تقريبًا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام منصة الاستزراع الغددي لعزل الخلايا المفردة عالية الإنتاجية لتعزيز إنتاجية تجارب الخلايا المفردة الخاصة بك. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب دخول فقاعات الهواء إلى القناة الدقيقة ومنع الخلايا من التكتل معاً مع مرور الوقت.