ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إثبات تصنيع وتشغيل شريحة الموائع الدقيقة ، مما يسمح بعزل وثقافة خلية واحدة عالية الكفاءة. توفر هذه الطريقة أداة مفيدة لأي منطقة من شأنها أن تستفيد من عزل الخلية المفردة والثقافة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها عالية الكفاءة في تحميل الخلايا المفردة في مصفوفات صغيرة كبيرة.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام التدفق اللطيف وقوة الجاذبية فقط لتشغيل الجهاز ، مما يقلل من تلف الخلية. يتجه المعنى الضمني لهذه التقنية نحو التشخيص النهائي للأمراض البشرية مثل السرطان ، حيث يؤثر عدم التجانس الخلوي على استجابة الخلية ، لذلك توصلنا إلى فكرة تطوير هذه الطريقة عندما كنا نؤسس خط خلايا microwell ، لأن طريقة التخفيف الحدي كانت تستغرق وقتا طويلا للغاية وغير فعالة. الآن يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتحليل الخلايا الفردية.

يمكن تطبيقه أيضا على تطبيقات أخرى مثل إنشاء وتوقيت مراقبة مسار الخلية الفردية وسلوكها. للبدء ، قم بتصنيع قوالب رئيسية سيليان لكل من طبقة عزل الخلية المفردة وطبقة ثقافة الميكروويل ، باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية القياسية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. لكل قالب رئيسي ، امزج 16 جراما من قاعدة PDMS مع 1.6 جرام من عامل المعالجة في كوب يمكن التخلص منه ، وحرك الخلطات حتى تمتزج.

بعد ذلك ، ضع القوالب الرئيسية في أطباق بتري مقاس 150 ملم ، واسكب PDMS فوق القوالب. ضع أطباق بتري في مجفف وقم بتطبيق مكنسة كهربائية لمدة ساعة لإزالة فقاعات الهواء من PDMS. بعد ساعة واحدة ، أخرجي الأطباق من المجفف وضعيها في فرن تقليدي على حرارة 65 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى ست ساعات لعلاج PDMS.

ثم أخرجي الأطباق من الفرن واتركيها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تبرد ، قم بتقشير مصفوفة التقاط بئر PDMS المعالجة ومصفوفة ثقافة microwell من القوالب الرئيسية وقم بقص الأجهزة باستخدام شفرة حلاقة. بعد ذلك ، استخدم ثقب 0.75 ملم لإنشاء ثقب واحد في كل طرف من طرفي القناة الدقيقة على طبقة مصفوفة بئر الالتقاط.

استخدم الشريط اللاصق لتنظيف ما سيصبح السطح الداخلي للجهاز ، ثم ضع الطبقات الفردية مع توجيه الأسطح الداخلية لأعلى في منظف البلازما لعلاج قصير ببلازما الأكسجين. عند الانتهاء ، قم بإزالة طبقات PDMS من منظف البلازما واستخدم مجهر استريو لمحاذاة الطبقات العلوية والسفلية من الجهاز وتوصيلها. ضع الجهاز المحاذاة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لإنشاء رابطة دائمة بين طبقات PDMS.

بعد ذلك ، ضع جهاز PDMS المستعبدين في ماء منزوع الأيونات وضع الحاوية في مجفف تحت الفراغ لمدة 15 دقيقة ، لإزالة الهواء من القناة الدقيقة للجهاز. مع إزالة كل الهواء الآن من الجهاز ، ضع جهاز PDMS في غطاء مزرعة الأنسجة واستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم سطح الجهاز لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل الماء منزوع الأيونات في الجهاز بألبومين مصل بقري بنسبة 5٪ في PBS واحتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

سيؤدي ذلك إلى سد السطح وتحسين كفاءة نقل الخلايا المعزولة من آبار الالتقاط إلى آبار الاستزراع. بعد 30 دقيقة ، استبدل محلول الحظر في الجهاز ب PBS معقم. قم بإعداد معلق أحادي الخلية يحتوي على 2.5 مليون خلية لكل مليلتر وقم بتحميل ماصة ب 50 ميكرولتر من التعليق.

بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى الجهاز من خلال فتحة مخرج الجهاز. قم بتحميل 50 ميكرولترا أخرى من تعليق الخلية وانقله إلى الجهاز من خلال فتحة المدخل لملء القناة الدقيقة بأكملها بالتساوي بالخلايا. بمجرد التحميل ، استخدم سدادة معقمة مصنوعة من خط صيد من النايلون بقطر ملليمتر واحد لإغلاق فتحة مخرج الجهاز.

بعد ذلك ، املأ حقنة معقمة سعة مليلتر واحد بوسط الثقافة ، وأخرج أي فقاعات هواء متبقية ، وضعها في مضخة المحقنة. قم بتوصيل إبرة حادة عيار 23 بالمحقنة واستخدم أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين لتوصيل الإبرة بمدخل الجهاز. بعد توصيل الأنبوب ، قم بإزالة القابس من فتحة المخرج وانتظر دقيقتين بينما تستقر الخلايا في آبار التقاط الخلية المفردة بقوة الجاذبية.

بعد ذلك ، اضبط مضخة الحقنة على 600 ميكرولتر في الدقيقة. قم بإزالة قابس المنفذ واغسل الخلايا غير الملتقطة لمدة 30 ثانية. انتظر دقيقتين حتى يستقر الضغط.

ثم قم بإزالة الأنبوب من مدخل الجهاز وأغلق فتحات المدخل والمخرج بمقابس لتشكيل نظام ثقافة مغلق. الآن اقلب الجهاز يدويا لنقل الخلايا المفردة التي تم التقاطها إلى الآبار الصغيرة للثقافة على الجانب الآخر من الجهاز. بعد ذلك ، ضع الجهاز في طبق زراعة الأنسجة 100 ملم ، وأضف 10 مل من PBS المعقم حول الجهاز ، وضع الطبق في حاضنة.

لاستبدال وسط الاستزراع ، ضع أولا قطرتين من وسط الاستزراع أعلى جهاز PDMS بالقرب من المدخل والمخرج لتجنب إدخال فقاعات الهواء في القناة الدقيقة. بعد ذلك ، استخدم أداة ثقب خزعة 0.75 ملم لعمل فتحتين من أعلى جهاز PDMS بالقرب من نهايات القناة الدقيقة. تأكد من تثقيب الطبقة العليا من الجهاز فقط.

بعد ذلك ، املأ حقنة بلاستيكية سعة مليلتر واحد تحتوي على وسط طازج مسخن مسبقا ، واستخدم إبرة حادة قياس 23 وأنبوب PTFE لتوصيلها بمنفذ المدخل الذي تم إنشاؤه حديثا. قم بتدفق ما يقرب من 120 ميكرولترا من الوسط الطازج ببطء إلى الجهاز على مدار خمس دقائق لاستبدال الوسط القديم. عند الانتهاء ، أغلق منافذ المدخل والمخرج باستخدام قابطين ، وأعد الجهاز إلى حاضنة زراعة الخلايا.

يتراوح عدد الخلايا التي ينتهي بها المطاف في آبار الالتقاط من حوالي 68٪ إلى 85٪ حسب نوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي معظم آبار الالتقاط على خلية واحدة فقط ، لجميع أنواع الخلايا الثلاثة. بعد نقل خلايا KT98 التي تم التقاطها إلى آبار الاستزراع ، كان حوالي 77٪ من الآبار تحتوي على خلية واحدة فقط ، و 16٪ لا تحتوي على خلايا ، و 6٪ بها خليتان ، وأقل من 1٪ من الآبار تحتوي على ثلاث خلايا أو أكثر.

على مدار سبعة أيام ، أظهرت الخلايا المفردة المعزولة أنماط نمو غير متجانسة. بينما تضاعفت بعض الخلايا ، لم تتكاثر البعض الآخر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام منصة ثقافة الغدد الصماء لعزل الخلية المفردة عالية الإنتاجية لتعزيز إنتاجية تجاربك ذات الخلية الواحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب دخول فقاعات الهواء إلى القناة الدقيقة ومنع الخلايا من التجمع معا مع مرور الوقت.