مدفوعة خفيفة الأنزيمية نزع الكربوكسيل

الهدف العام من هذه التجربة هو دفع التفاعلات الأنزيمية باستخدام الضوء المرئي. في هذا النهج ، يتم استخدام الضوء لتحويل الأحماض الدهنية إلى ألكينات طرفية في ظل ظروف تفاعل معتدلة. يتطلب نزع الكربوكسيل كسر روابط CC.

وهذه الرابطة مستقرة للغاية، مما يجعل هذا رد فعل صعب للغاية. يعد استخدام الضوء نهجا مستداما لتحقيق مثل هذا التفاعل الصعب. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حاولنا إضافة بيروكسيد الهيدروجين مباشرة إلى التفاعل ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيمات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر كمية ثابتة من بيروكسيد الهيدروجين. أولا ، استخدمنا OleT المنقى للتحفيز الحيوي الذي يحركه الضوء لتوصيف الإنزيم الخاص بنا. في وقت لاحق اختبرنا أيضا مستخلص الخام الذي سيكون مهما لتطوير التطبيقات الصناعية.

بعد استنساخ جين OleT الاصطناعي في ناقل التعبير وتحويل البلازميد إلى بكتريا قولونية كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتلقيح الخلايا في أنبوبي اختبار يحتويان على ثلاثة ملليلتر من وسط LB ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين. احتضن الثقافات المسبقة في شاكر لمدة 15 ساعة. خفف ملليلترين من المزرعة إلى 200 مل من LB مع الأمبيسلين في قارورتين سعة لتر واحد.

احتضان القوارير في شاكر عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة حتى تصل المزارع إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر بين 0.6 و 0.8. بعد ذلك ، أضف 0.5 مللي مولار من حمض دلتا أمينوليفولينيك إلى الثقافات. ثم تحفز الخلايا بإضافة التتراسيكلين بمعدل 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر إلى القوارير.

احتضان الثقافات لمدة 15 ساعة عند 20 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. بعد الحث ، صب الثقافات في أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 12000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الكريات عن طريق سحب 50 مل من محلول Tris البارد المثلج وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل. استمر في الطرد المركزي عند 4000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في ثلاثة ملليلتر من العازلة عن طريق تكرار سحب العينات.

قم بتحلل الخلايا عن طريق صوتنة بثلاث دورات مدتها 30 ثانية تتوقف لمدة دقيقة واحدة بين الدورات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 15000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتقطيع المستخلص الخالي من الخلية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية الشكل. لتحضير المستخلص الخام للتحفيز الحيوي المدفوع بالضوء ، انقل ثلاثة ملليلتر من مستخلص خلية واحدة خالية من الخلية إلى مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون وجهاز طرد مركزي عند 4000 مرة G، عند أربع درجات مئوية لإزالة الجزيئات الصغيرة.

أعد تعليق البروتين في ثلاثة ملليلتر من Tris. لتوصيف نشاط OleT في التحفيز الحيوي الذي يحركه الضوء ، يحتاج البروتين إلى التنقية. لبدء تنقية البروتين ، قم بتحميل ثلاثة ملليلتر من المستخلص الحر للخلية على أعمدة دوران NTA النيكل المتوازنة.

أغلق الأعمدة بالمقابس السفلية وأغطية البراغي. ورجها برفق حتى يتوزع الراتنج بالتساوي. استمر باحتضان الأعمدة في شاكر علوي.

ثم الطرد المركزي العمود. بعد ذلك ، اغسل الأعمدة بإضافة مليلتر واحد من عازلة الغسيل والطرد المركزي لها عند 700 مرة G لمدة دقيقتين. كرر الغسيل مرتين أخريين.

بعد الغسيل ، ضع الأعمدة في أنابيب طرد مركزي مخروطية وأضف ملليلترا واحدا من مخزن الشطف إلى كل عمود. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 700 مرة G لمدة دقيقتين وكرر الشطف مرتين أخريين. أضف مستخلصات العمود المدمجة إلى مرشح طرد مركزي 10 كيلودالتون وقم بطرده عند 4000 مرة جرادا وأربع درجات مئوية لفصل الإيميدازول المستخدم في الشطف عن الإنزيم.

أخيرا ، حدد نقاء البروتين وتركيزه كما هو موضح في بروتوكول النص. لبدء إجراء التحول الحيوي ، أضف أولا 10٪ من مادة خافضة للتوتر السطحي مثل الترجيتول و 28.4 ملليغرام من حمض دهني إلى الماء المقطر لصنع 10 ملليلتر من محلول مخزون 10 ملليمول. سخني المحلول في غرفة تسخين على حرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب حمض دهني تماما.

استخدم هذا المحلول لتحضير خليط التفاعل وفقا للبروتوكول التالي. أضف FMN و EDTA و BUFFER وحمض دهني إلى أنبوبين زجاجيين شفافين وحركها في حمام مائي عند 25 درجة مئوية. استمر بإضافة 200 ميكروغرام لكل مليلتر من الإنزيم المنقى أو المستخلص الخام إلى الأنابيب.

وتضيء بمصباح LED شفاف على مسافة سنتيمترين. بعد ذلك ، خذ 200 عينة ميكرولتر في نقاط زمنية محددة في أنابيب مملوءة مسبقا ب 20 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ لإيقاف التفاعلات. ثم أضف خمسة ميكرولترات من محلول حمض الميريستيك 10 ملليمولار إلى كل عينة كمعيار داخلي.

لتحليل نواتج التفاعل ، أضف مرتين 500 ميكرولتر من أسيتات الإيثيل إلى الأنابيب. اقلب الأنابيب لخلطها وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 13 ، 000 مرة G.Next ، قم بنقل 400 ميكرولتر من المواد الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتبخرها تماما عن طريق النفخ برفق على الأنابيب بالهواء المضغوط. أضف 200 ميكرولتر من MSTFA إلى الأنابيب.

واحتضان الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لاشتقاق العينات قبل التحليل. قم بتحليل نواتج التفاعل عن طريق حقن عينة من أربعة ميكرولتر في كروماتوجراف غاز مزود بكاشف تأين اللهب باستخدام ملف تعريف درجة الحرارة الموصوف في بروتوكول النص. بعد ذلك ، حدد نسبة سباعي وحمض بيتا هيدروكسي واحد يتكون في كل عينة تفاعل مع كروماتوجراف غاز مقترن بمطياف كتلة.

استخدم إعدادات درجة حرارة الفرن ومطياف الكتلة كما هو موضح في بروتوكول النص. حقن ميكرولتر واحد من كل عينة في كروماتوجراف الغاز وسجل الكروماتوجرام. أخيرا ، راقب كروماتوجرامات GCMS لكل عينة وقم بتحليلها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تم تحديد الأوزان الجزيئية للمنتجات من التفاعلات الأنزيمية باستخدام كروماتوجراف الغاز المقترن بمطياف الكتلة. بالنسبة للأحماض الدهنية ذات سلاسل الأسيل الأطول ، فإن إنزيم OleT يحفز بشكل تفضيلي نزع الكربوكسيل إلى أوليفينات بأطوال مختلفة. تم تحليل عينات من تفاعل التحول الأحيائي بواسطة كروماتوجراف غازي مزود بكاشف تأين اللهب.

تبين أن نزع الكربوكسيل من حمض دهني يحدث أسرع بثلاث مرات من تفاعل الهيدروكسيل مع تحويل 99٪ من حمض دهني إلى خليط 3.3: 1 من سباعي واحد إلى حمض دهني 2-هيدروكسي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التحفيز الحيوي المدفوع بالضوء في غضون ساعات قليلة إذا قلت إنني أؤدي بشكل صحيح. في التحفيز الخفيف ، يتمثل التحدي في ربط التفاعلات المفيدة بحصاد الضوء.

في حالتنا ، لدينا الضوء داخل جزيء FMN كمحسس للضوء وربطه بالإنزيم الخاص بنا عبر جزيء النقل وهو بيروكسيد الهيدروجين.