التصوير المقطعي والتصوير الضوئي من-تكون العظم الأوعية الدموية اقتران لتقييم دمج القحف طعم ذاتي العظام والمغايرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة اندماج طعوم العظام القحفية من حيث تجدد العظام وتكون الأوعية الدموية الجديدة باستخدام مناهج التصوير متعدد الأنماط. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الطب التجديدي، مثل الاقتران بين تكوين العظام وتكون الأوعية الدموية. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر تحديداً ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للشجرة الوعائية، وتسمح بدراسة العضو كاملاً؛ حيث سيقوم doron Vic، طالب الدكتوراه في مختبري، بتنفيذ الإجراء بعد القتل الرحيم لفئران Bab في عمر يتراوح بين سبعة إلى ثمانية أسابيع.

وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم ماكينة حلاقة لشعر الحيوانات لحلاقة منطقة القحف عكس اتجاه نمو الشعر. ضع 70%isopropanol على الجثة، وتحديداً منطقة الرأس، للتطهير. ثم استخدم مشرطاً رقم 11 لقطع جلد فروة الرأس وإزالة السمحاق باستخدام مثقاب أسنان وسن بقطر داخلي يبلغ 4.5 millimeter.

قم بفصل قطعة دائرية من عظم الجمجمة. انقل قطعة العظم إلى طبق بلاستيكي بقطر 100 مليمتر يحتوي على محلول ملحي معقم. في هذه المرحلة، افحص الدم والأنسجة الرخوة الملتصقة بقطعة العظم باستخدام ملقط منحني.

أمسك قطعة واحدة من شظايا العظم في كل مرة واستخدم مسحة قطنية لمسحها جيداً، وذلك لإزالة أي أنسجة دماغية أو أنسجة رخوة أو دم. استخدم مقصاً دقيقاً لقص أي رقائق عظمية تظل ملتصقة بالرقعة برفق، حتى تكتسب الرقعة شكلاً مستديراً مثالياً.

اغمر كل طعم مرة واحدة في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على 70%ethanol ومرتين في أنابيب سعة 15 milliliter تحتوي على PBS لغسل الإيثانول. جمد الطعم الخيفي في مجمد درجة حرارته minus 80 degrees Celsius في أنابيب تجميد لمدة أسبوع واحد على الأقل بعد التجميد. تأكد من أن الطعم الخيفي يبدو شفافاً عند العمل مع الفئران المعدلة وراثياً المستقبلة التي تعبر عن luciferase تحت تحكم محفز osteocalcin.

بعد تخدير فأرة أنثى يتراوح عمرها بين سبعة إلى ثمانية أسابيع باستخدام مواد تخدير قابلة للحقن والتحقق من حالة التخدير، استخدم ماكينة حلاقة للشعر في عكس اتجاه نمو الشعر لحلاقة منطقة القحف. ضع مزيلاً للشعر لإزالة أي بقايا من الفراء، ثم استخدم شاشاً جافاً لمسحه بعد فترة لا تتجاوز دقيقتين.

ثم استخدم شاشاً مغموساً في المحلول الملحي لمسح المنطقة. قم بتطهير فروة الرأس عن طريق حقن الكلورهيكسيدين بتركيز 5% تحت الجلد. احقن خمسة مليغرام لكل كيلوغرام من كاربروفين مخفف في 200 µL من المحلول الملحي.

ضع مرهم العين لمنع الجفاف وأبقِ الحيوان على وسادة حرارية في جميع الأوقات. ثم ضع الحيوان تحت منظار الجراحة. بعد ذلك، وباستخدام مقص دقيق وملاقط، قم بعمل شق بيضاوي بطول واحد سنتيمتر في جلد فروة الرأس باستخدام الملاقط.

ثبّت السمحاق واستخدم مقصاً دقيقاً لإزالته، ثم استخدم مثقاب أسنان ومثقاب تحسين بقطر خارجي يبلغ 5 mm لتوسيع عيب القحف على مسافة 2 mm أمام الدرز اللمبدي لتجنب اختراق الأم الجافية. احفر لمسافة تصل إلى ثلاثة أرباع عمق العظم واستخدم ملعقة (spatula) لفصل قطعة العظم. وتعتبر عملية تحديد موقع العيب خطوة حاسمة في هذا البروتوكول.

سيؤدي إصابة الغرزة المختبرية إلى نزيف حاد. لذلك، يجب توخي الحذر لتجنب تعطيل المقياس الصلب الأساسي والجيب السهمي العلوي. لزراعة طعم ذاتي.

استخدم 10 milliliters من المحلول الملحي المعقم في طبق بلاستيكي بقطر 10 millimeter لغسل قطعة العظم. قم بإزالة التجلطات الدموية دون إزالة الأنسجة الرخوة لزراعة طعم خيفي تم إذابته مسبقاً وموازنة درجة حرارة العينة مع درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل قطعة العظم باستخدام ملاقط منحنية.

ضع الطعم العظمي في مكان العيب بحيث لا يلامس حواف العيب. ثم استخدم هلام الفبرين لتثبيت الطعم بالعظم المضيف. قم بخياطة الجلد باستخدام خيوط Vicryl مقاس 4-0، وضع البوفيدون جودين على الشق الجراحي.

قم بتمييز أذن الفأر وحقن 0.25 milligrams per kilogram من مضاد السينسيدان (anti sedan) لعكس التأثير التخديري للميديتوميدولين (medetomidine). قم بإجراء الرعاية ما بعد الجراحة وفقاً لبروتوكول النص.

قم بتحضير المحلول الملحي المضاف إليه الهيبارين عن طريق وزن 2000 وحدة من هيبارين الصوديوم ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مللتر. أضف 20 مللتر من المحلول الملحي المعقم إلى الأنبوب ورجه جيداً. املأ محقنة lure lock سعة 20 مللتر بـ 15 مللتر من المحلول الملحي المضاف إليه الهيبارين والمدفأ، ثم قم بتوصيل المحقنة بمجموعة إبرة وريدية (scalp vein set) مقاس 23 gauge.

قم بتثبيت المحقنة في مضخة محاقن واضبط المضخة على 10 milliliters بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة (1 milliliter per minute). بعد تخدير الفأر وفقاً للبروتوكول النصي، تحقق من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم وثبّت الفأر على ظهره فوق لوح تثبيت مغطى ببطانة سطح ممتصة.

بعد ذلك، يتم قص الجلد من البطن وصولاً إلى الرقبة. ثم يتم قص جدار البطن صعوداً حتى الناتئ الخنجري. بعد ذلك، يتم قص القفص الصدري على طول جانبه الوحشي، مع التأكد من كشف القلب بالكامل وعدم إلحاق أي ضرر بالقلب والرئتين.

استخدم ملقط شرياني لإبعاد عظمة القص. أدخل إبرة الفراشة لمسافة ثلاثة مليمترات في البطين الأيسر. ثم باستخدام غراء لمدة ثلاث ثوانٍ، قم بتثبيت الإبرة في القلب وجدار الصدر. إن إدخال إبرة الفراشة في البطين الأيسر إجراء دقيق.

حاول تجنب الإدخال في البطين الأيمن أو التوغل بشكل كبير في البطين الأيسر لأن ذلك سيؤدي إلى اختراق الجدار الخلفي للقلب. بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة على الفور. وبعد مرور دقيقة واحدة، قم بتشريح الوريد الأجوف السفلي من أجل تخفيف الضغط عن الأوعية الدموية.

أَمِل اللوحة بحيث تتدفق السوائل بعيداً عن الرأس. سيؤدي التروية الناجحة إلى تصفية الكبد والأوعية الدموية. الآن، قم بتروية 10 milliliters من 4%formaldehyde.

تجنب تغلغل فقاعات الهواء في الأوعية الدموية. عند اكتمال عملية التروية، وهو ما يُستدل عليه بتصلب الذيل، استخدم 10 milliliters من المحلول الملحي الممزوج بالهيبارين لشطف الفورمالديهايد. قم بتحضير عامل التباين المعتم للأشعة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

عن طريق خلط المخفف المركب وعامل المعالجة في أنبوب بلاستيكي، يتم تروية الحيوان باستخدام المادة المباينة بمعدل 1 ml في الدقيقة. يجب أن تتحول الشرايين التاجية والمعوية والكبدية إلى اللون الأصفر عند اكتمال التروية. اقطع الأنبوب المتصل بإبرة الفراشة ولف الجثة في ورق لمنع تسرب المحلول إلى منطقة القحف.

يُحفظ الحيوان في درجة حرارة 4 °C طوال الليل للسماح بعملية البلمرة في اليوم التالي. ولتشريح منطقة القحف، استخدم مشرطاً لقص الجلد في أبعد نقطة جانبية ممكنة، مع تجنب إتلاف المنطقة القحفية المستهدفة. حدد موقع الطعم العظمي، ثم استخدم مقصاً دقيقاً لقص العظم القحفي على بُعد 10 mm من الطعم.

باستخدام ماسح micro CT، يتم ضبط مجال الرؤية على 20.5 millimeters، وطاقة الأشعة السينية على 55 KVP، والشدة على 145 microamps، مع التقاط ألف مسقط لكل 360 درجة، وزمن تكامل قدره 200 milliseconds. ثم يتم مسح عينة عظم القحف المعزولة.

افحص المقاطع المعاد بناؤها ثنائية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج micro CT. تأكد من مسح المنطقة المستهدفة بشكل صحيح، ثم حدد موقع عيب القحف. إذا كانت الأوعية الدموية المروية قابلة للتحديد بسهولة، فاستخدم 6%trichloroacetic acid المخفف في ماء مقطر مزدوج.

لإزالة الكالسيوم من العينة، أعد مسح العينة باستخدام نفس المعايير الموصوفة سابقاً. حدد موقع الدرز اللامبدويدي في المقاطع ثنائية الأبعاد المعاد بناؤها. حدد حجماً أسطوانياً لمنطقة الاهتمام (VOI) بارتفاع 2 mm وقطر 8 mm بحيث يكون مماسياً للدرز.

هذا هو الموقع التشريحي للعيب. بعد ذلك، يتم فصل العظم عن الأنسجة الرخوة. اضبط العتبة الدنيا على 130 وطبق مرشح غاوسي ثلاثي الأبعاد مقيد (constrained 3D Gaussian Filter) لتثبيط الضوضاء جزئياً في الأحجام.

قم بإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. تأكد من وضع منطقة الاهتمام (VOI) بشكل صحيح باستخدام برنامج IPL وكائن DT. تقوم وظيفة Peram بإنشاء خريطة للسماكة.

تصف هذه الدالة حجم الوعاء الدموي لكل قطر وعاء تم تصويره باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. وفقاً للبروتوكول النصي، كما هو موضح هنا، أظهر المسح المقطعي المحوسب بعد سبعة أيام من الجراحة حجماً أكبر بكثير من الأوعية الدموية ذات الأقطار الصغيرة والمتوسطة التي غذت منطقة الطعم بالكامل في الفئران التي تلقت طعوماً ذاتية، وذلك مقارنة بالفئران التي تلقت طعوماً خيفية حيث بدت الأوعية وكأنها تخترق من الخارج. بالإضافة إلى ذلك، أظهر التصوير الفلوري تروية دموية أعلى بكثير في الحيوانات المعالجة بالطعوم الذاتية.

بحلول اليوم 14، وصلت الشجرة الوعائية في الطعم الخيفي إلى جميع أنحاء الطعوم. ومع ذلك، كان حجم الأوعية أقل بكثير مقارنة بمجموعة الطعم الذاتي. وكان هذا الاختلاف أكثر وضوحاً عند مقارنة الأوعية التي تتراوح أقطارها بين 0.08 إلى 0.1 مليمتر، وكما هو موضح هنا، فقد عاد حجم الأوعية الدموية إلى المستوى الأساسي بعد سبعة أيام من الجراحة، وذلك بعد 28 يوماً من العملية الجراحية.

أظهرت مجموعة الطعم الذاتي تمعدناً عظمياً أكبر بشكل ملحوظ كما ظهر في التصوير الفلوري باستخدام مسبار موجه نحو الهيدروكسيباتيت. وقد تشكل العظم في جميع أنحاء المنطقة المجاورة للطعم في هذه المجموعة، بينما تشكل فقط عند حواف العيب في مجموعة الطعم الخارجي على شكل حلقة بعد 56 يوماً من الجراحة؛ وكان حجم العظم أعلى بشكل ملحوظ وسماكة الطعم أكبر بشكل ملحوظ في الحيوانات التي تلقت طعوماً ذاتية مقارنة بتلك التي تلقت طعوماً خارجية. وبمجرد إتقان هذه التقنية الجراحية، يمكن تنفيذها في غضون 25 دقيقة تقريباً. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التصوير الفلوري باستخدام مسابير أخرى للإجابة على أسئلة إضافية، مثل أنشطة ناقضات العظم ومشاركة الاستجابة المناعية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير تجدد العظام في عملية تكوين الأوعية الدموية الكامنة.