تحليل يستند الخلوي-Imaging- وتدفق الوظيفة خلية ودورة الخلية في 3D الميلانوما الأجسام الشبه الكروية

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد وتوصيف وعزل الخلايا من عضواني ستيرويدي متعدد الخلايا فيما يتعلق بحالة دورة الخلية وموقعها داخل الستيرويد مقارنة بزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D). يعيد نموذج OID ثلاثي الأبعاد (3D) محاكاة بيولوجيا السرطان داخل الجسم الحي، حيث يحاكي بنية الورم وبيئته الدقيقة. ومن خلال الربط بين الكريات (spheres) وتقنيات قياس التدفق الخلوي والتصوير، يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السرطان، مثل كيفية تأثير البيئة الدقيقة للورم على الحساسية للدواء، وحركية الخلايا، والتكاثر.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تتيح التصور في الوقت الفعلي للدورة الخلوية، وتسمح بتنقية الخلايا الحية من منطقة ستيرويدية محددة، مما يثبت فاعلية الإجراء؛ ستقوم "أشارب"، وهي مساعدة بحثية من مختبرنا، ببدء التحضير لتكوين الستيرويد ثلاثي الأبعاد عن طريق تسخين 1.5% aros في 100 milliliters من محلول هانكس الملح المتوازن أو HBSS في الميكروويف لمدة ثلاث إلى خمس دقائق، مع تحريك القارورة بشكل متقطع لضمان ذوبان aros تمامًا. بعد ذلك، يتم سحب 100 µL من محلول aros فورًا بواسطة الماصة ووضعها في كل بئر من آبار طبق زراعة الأنسجة ذي القاع المسطح والمكون من 96 بئرًا. يُحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح لـ aros بالتصلب.

بعد ذلك، قم بإخراج مزرعة خلايا ميلانوما وصلت درجة تلاقيها إلى 80% وتعبر عن بنى FCI من حاضنة زراعة الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام 10 milliliters من HBSS. أضف 1.5 milliliters من 0.05% EDTA ثم حضن الخلايا عند 37 degrees Celsius لمدة دقيقتين تقريبًا.

بمجرد انفصال الخلايا، قم بتعليقها في 10 milliliters من وسط استنبات الخلايا. قم بعدّ الخلايا يدويًا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) ومجهر مقلوب، ثم خففها لتصل إلى 25,000 خلية لكل milliliter في وسط استنبات الخلايا. بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة 200 microliters من معلق الخلايا لتغطية كل بئر من آبار طبق 96 well aros.

تُحضن الأطباق عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide لمدة ثلاثة أيام تقريبًا لتكوين كرويات خلوية. وبعد فترة التحضين، يتم تصوير الكرويات باستخدام مجهر مقلوب مع عدسة Forex ومرشح تباين طوري. يجب أن تظهر الكرويات على شكل تجمعات خلوية مدمجة وكروية تقريبًا لتجهيز الكروية الخلوية للتقطيع والتصوير.

استخدم ماصة سعة 1 مل لنقلها إلى أنبوب فالكون. بعد ذلك، اترك الستيرويد يترسب في قاع الأنبوب المخروطي. ثم قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط، ومن ثم ثبت الكريات عن طريق تحضينها في محلول فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

يمكن بعد ذلك تخزين SP في محلول HBSS عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لعدة أيام بعد تقطيع الخلية وتصويرها. افتح برنامج تحليل الصور واختر تكوين القياس الكمي فقط. ثم أنشئ مكتبة جديدة واستورد ملف صورة spheroid confocal عن طريق سحب ملف البيانات الخام إلى المكتبة.

بعد ذلك، انتقل إلى علامة تبويب القياسات (measurements) لإنشاء بروتوكول تحليل الصور عن طريق سحب وإفلات الأوامر بالترتيب الصحيح في نافذة البروتوكول. للعثور على الأجسام في القناة الخضراء، اسحب وأفلت أمر "العثور على الأجسام" (find objects) من قسم البحث إلى نافذة البروتوكول واختر القناة المناسبة. أضف أمر "فتح" (open) الموجود تحت قسم المعالجة، ثم أضف أمر "فصل الأجسام المتلامسة" (touching objects) بشكل منفصل لفصل الخلايا.

وأخيرًا، من قسم التصفية (filtering section)، قم بإضافة واستبعاد الكائنات بناءً على الحجم. استخدم أمرًا لاستبعاد الكائنات التي يقل حجمها عن 50 micrometers لإزالة الكائنات الصغيرة غير الخلوية. بعد ذلك، قم بسحب وإفلات أمر "البحث عن الكائنات" (find objects) جديد في نافذة البروتوكول.

باتباع الخطوات نفسها، حدد القناة الحمراء ثم طبق جميع الأوامر اللاحقة. وبمجرد العثور على الكائنات، استخدم أوامر "إخفاء القناة" (hide channel) أو "إظهار القناة" (show channel) للتأكد بصرياً من أن الكائنات الحمراء والخضراء تتوافق مع النوى الحمراء والخضراء. وإذا لزم الأمر، انقر فوق "القياسات" (measurements) ثم "خيارات التغذية الراجعة" (feedback options) لتعديل مظهر أقنعة الكائنات.

للعثور الآن على الأجسام الصفراء التي تقابل خلايا مرحلة S المبكرة، استخدم أمر التقاطع (intersect) الموجود في قسم الدمج (combining)، واختر تقاطع الأجسام الحمراء مع الأجسام الخضراء. ومرة أخرى، استبعد الأجسام التي يقل حجمها عن 50 micrometers. ولتحديد خلايا مرحلة G1، استخدم أمر الطرح (subtract) الموجود في قسم الدمج، واختر طرح الأجسام الصفراء من الأجسام الحمراء للعثور على الأجسام الحمراء فقط.

وبالمثل، اطرح الأجسام الصفراء من الأجسام الخضراء من أجل تحديد الأجسام الخضراء حصرياً والتي ترتبط بـ SG two وخلايا مرحلة MPH لكل من الأجسام الحمراء حصرياً والخضراء حصرياً. قم بإزالة الأجسام غير الخلوية حسب الضرورة عن طريق تطبيق أمر تصفية المجتمع (filter population) من قسم التصفية بمعامل شكل أكبر من 0.25. بعد ذلك، حدد المخطط الخارجي لـ S spheroid.

استخدم أمر "find objects" من قسم "finding" في القناة الخضراء أو الحمراء. استخدم أمر "closed" من قسم "processing" لدمج الخلايا الفردية في كائن واحد. ثم أضف أمر "fill holes in objects" لملء الثقوب الموجودة في الكرات.

بعد ذلك، استخدم مرشحاً دقيقاً (fine filter) لإزالة الضجيج من كائن الـ Sphero. أكمل عملية تحديد المخطط الخارجي للشكل الكروي عبر اختيار "استبعاد الكائنات حسب الحجم" (exclude objects by size) لإزالة الكائنات التي يقل حجمها عن 30,000 micrometers. وبمجرد تحديد جميع الكائنات، أضف خيار "قياس المسافات" (measure distances) من القسم ذي الصلة لتحديد المسافة من كل OID إلى حافة المخطط الخارجي للـ S spheroid.

كرر هذه العملية في كل من المجموعات ذات اللون الأصفر، والحمراء فقط، والخضراء فقط. ولتصوير أدنى المسافات من الخلية إلى أقرب حافة لكروي S، افتح علامة تبويب القياسات (measurements) واختر خيارات التغذية الراجعة (feedback options) ثم العلاقات (relationships). بعد ذلك، اختر إظهار المسافات (show distances).

أخيرًا، احفظ البروتوكول لحفظ البيانات التي أنشأها البروتوكول. اختر بند "إجراء القياس" (make measurement) من قسم القياس. ثم لتفسير البيانات، حدد بند القياس، وانتقل إلى علامة تبويب التحليل في قسم القياس، واختر "تحليل" (Analyze) من قائمة التحليل لحساب الخلايا الموجودة على مسافة معينة من حافة الستيرويد.

قم بإنشاء مرشح عن طريق اختيار filter من علامة التبويب analysis. على سبيل المثال، اعرض فقط البيانات التي تكون فيها المسافة من حافة الكرة أقل من 100 microns. لتصدير البيانات الخام، اختر export من علامة التبويب file ثم احفظ البيانات كنص مفصول بفواصل أو محدد بعلامات جدولة.

يمكن فتح هذه البيانات في برنامج جداول بيانات لإجراء المزيد من التحليل. تم توليد الكريات الخلوية من C 8 1 16 1. تم تثبيت وتقطيع خلايا الميلانوما البشرية التي تم نقل الجينات إليها باستخدام نظام Fuji.

تم إجراء التصوير المجهري البؤري (Confocal imaging) باستخدام صبغة AZA green، التي تميز الخلايا في طور M الثاني من مرحلة SG في الدورة الخلوية، وصبغة Berra orange، التي تميز الخلايا في طور G1. وعند دمج هذه الصور، يمكن ملاحظة السمات الرئيسية مثل النواة النخرية (necrotic core) كما هو متوقع. وتطغى الخلايا المتوقفة في طور G1 (باللون الأحمر) بالقرب من هذه النواة النخرية، بينما تزداد الخلايا المتكاثرة باللونين الأحمر والأخضر بشكل متدرج نحو الحافة الخارجية لـ steroid، حيث يكون الوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية في أعلى مستوياته.

بعد تحليل الصور شبه الآلي، يمكن تحديد أقنعة خلايا fucci ومخطط S spheroid. استُخدم برنامج تصوير لتقدير كمية الخلايا الحمراء والخضراء في المنطقة الداخلية أو الخارجية من S spheroid. وأظهر هذا التحليل أن الخلايا المتوقفة في طور G one تكون متراكمة في المنطقة الداخلية، بينما تسود الخلايا المتكاثرة بالقرب من حافة steroid.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أسبوع إلى أسبوعين، وهو إطار زمني يشمل تنمية العضواني (steroid)، والتصوير والتحليل. وبعد هذه الإجراءات، يمكن زرع الأورام في مصفوفة كولاجين ثم تصويرها عبر المجهر بنظام التصوير الزمني (TimeLapse microscopy). ومن ثم يمكن إخضاعها لتحليل البروتين أو RNA، مما قد يساعدنا في الإجابة على أسئلة مثل ما إذا كان الموقع داخل العضواني والوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية يمكن أن يغير الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية.