تحليل يستند الخلوي-Imaging- وتدفق الوظيفة خلية ودورة الخلية في 3D الميلانوما الأجسام الشبه الكروية
ديسمبر 28, 2015
نصف طريقتين تكميليتين باستخدام مؤشر دورة الخلية في كل مكان (FUCCI) وتحليل الصور أو قياس التدفق الخلوي لتحديد وعزل الخلايا في المناطق الداخلية G1 المحتجزة والخارجية للكفيريات ثلاثية الأبعاد.
الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد, توصيف, وعزل الخلايا من الستيرويد متعدد الخلايا فيما يتعلق بحالة دورة الخلية وموقعها داخل الستيرويد مقارنة بثقافة الخلايا 2D. يلخص نموذج OID ثلاثي الأبعاد بيولوجيا السرطان في الجسم الحي لأنه يحاكي بنية الورم وبيئته المكروية من خلال إقران الأفير مع قياس التدفق الخلوي وتقنيات التصوير. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان ، مثل كيفية تغيير البيئة الدقيقة للورم ، وحساسية الدواء ، وحركة الخلايا ، والانتشار.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تتيح التصور في الوقت الفعلي لدورة الخلية وتسمح بتنقية الخلايا الحية من منطقة ستيرويد معينة مما يدل على أن الإجراء سيتم القيام به حاد ، مساعد باحث من مختبرنا ابدأ في التحضير لتشكيل الستيرويد ثلاثي الأبعاد عن طريق وضع 1.5٪ في الميكروويف في 100 مل من محلول ملح توازن هانك أو HBSS أو ثلاث إلى خمس دقائق قم بتدوير القارورة بشكل متقطع لضمان أن يذوب AROS تماما. ثم قم على الفور بعمل 100 ميكرولتر من محلول aros في كل بئر من لوحة زراعة أنسجة الآبار ذات القاع المسطح 96. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح للأروس بالتصلب.
بعد ذلك ، قم بإزالة ثقافة خلايا التقاء 80٪ لخلايا الورم الميلانيني التي تعبر عن تركيبات FCI من حاضنة زراعة الخلايا. اغسل الخلايا ب 10 مل من HBSS. أضف 1.5 مل من 0.05٪ في EDTA ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين تقريبا.
بمجرد أن تنفصل الخلايا عن الريس، قم بتعليقها في 10 ملليلتر من زراعة الخلايا. متوسط. عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم ومقياس الخلوي والمجهر المقلوب وتخفيفها إلى 25 ، 000 خلية لكل مليلتر في وسط زراعة الخلايا. ثم ماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لتراكب كل بئر من لوحة 96
بئر.احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام تقريبا لتشكيل كرويات الخلية. بعد صورة الحضانة ، الكرويات على مجهر مقلوب باستخدام هدف الفوركس ومرشح تباين الطور. يجب أن تظهر الكرات الكروية كمجاميع الخلايا الكروية المدمجة تقريبا لإعداد الستيرويد الخلية للتقسيم والتصوير.
استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لنقلها إلى أنبوب الصقر. ثم السماح للستيرويد لتستقر في الجزء السفلي من المخروطي. بعد ذلك ، قم بإزالة الشفط الثنائي المتوسط ثم قم بإصلاح الأكروية عن طريق احتضانها في شكل مخزن محايد بنسبة 10٪ لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
يمكن بعد ذلك تخزين SP في HBSS عند أربع درجات مئوية لعدة أيام بعد تقسيم الخلية وتصويرها. افتح برنامج تحليل الصور واختر تكوين الكمية فقط. ثم قم بإنشاء مكتبة جديدة وقم باستيراد ملف الصورة متحد البؤر الكروي عن طريق سحب ملف البيانات الأولية إلى المكتبة.
بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب القياسات لإنشاء بروتوكول تحليل الصور عن طريق سحب الأوامر وإفلاتها بالترتيب الصحيح في نافذة البروتوكول. للعثور على الكائنات في القناة الخضراء، اسحب الأمر Find objects وأفلته من قسم البحث في نافذة البروتوكول وحدد القناة المناسبة. أضف أمرا مفتوحا موجودا ضمن المعالجة ثم أضف أمر كائنات لمس منفصل لفصل الخلايا.
أخيرا ، من قسم التصفية ، أضف واستبعد الكائنات حسب الحجم. أمر للكائنات التي يقل حجمها عن 50 ميكرومتر لاستبعاد الكائنات الصغيرة غير الخلوية. بعد ذلك ، قم بسحب وإفلات أمر جديد للبحث عن الكائنات في نافذة البروتوكول.
باتباع نفس الخطوات ، حدد القناة الحمراء وقم بتطبيق جميع الأوامر اللاحقة. بمجرد العثور على الكائنات، استخدم أوامر إخفاء القناة أو إظهار القناة للتأكد بصريا من أن الكائنات الحمراء والخضراء تتوافق مع النوى الحمراء والخضراء. إذا لزم الأمر ، انقر فوق القياسات ثم خيارات التغذية الراجعة لتعديل مظهر أقنعة الكائن.
الآن للعثور على كائنات صفراء تتوافق مع خلايا المرحلة S المبكرة ، استخدم أمر التقاطع الموجود في قسم الدمج واختر تقاطع الكائنات الحمراء مع الكائنات الخضراء. مرة أخرى ، استبعد الأشياء بحجم أقل من 50 ميكرومتر. لتحديد خلايا G أحادية الطور ، استخدم أمر الطرح الموجود في قسم الدمج واختر طرح كائن أصفر من الكائنات الحمراء للعثور على كائنات حمراء حصرية.
وبالمثل ، اطرح الكائنات الصفراء من الكائنات الخضراء من أجل تحديد الكائنات الخضراء حصريا التي ترتبط بخلايا الطور SG two و MPH لكل من الكائنات الحمراء الحصرية والخضراء حصريا. قم بإزالة الكائنات غير الخلوية حسب الضرورة عن طريق تطبيق أمر مجموعة عوامل التصفية من قسم التصفية بعامل شكل أكبر من 0.25. ثم أوجد المخطط الكروي S.
استخدام أمر البحث عن الكائنات من قسم البحث في القناة الخضراء أو الحمراء. استخدم أمرا مغلقا من قسم المعالجة لضم الخلايا الفردية إلى كائن واحد. ثم أضف أمر تعبئة الثقوب في الكائنات لملء الثقوب في الشقة.
بعد ذلك ، استخدم مرشحا دقيقا لإزالة الضوضاء من كائن Sphero. قم بإنهاء العثور على المخطط الكروي عن طريق اختيار استبعاد الكائنات حسب الحجم لإزالة الكائنات الأصغر من 30,000 ميكرومتر. بمجرد تحديد جميع الكائنات، أضف مسافات القياس من القسم ذي الصلة لتحديد المسافة من كل OID إلى حافة المخطط الكروي S.
افعل ذلك في كل من السكان الأصفر والأحمر الحصري والأخضر حصريا. لتصور المسافات الدنيا من الخلية إلى أقرب حافة كروية S، افتح علامة تبويب القياسات وحدد خيارات التغذية الراجعة متبوعة بالعلاقات. ثم اختر عرض المسافات.
أخيرا ، احفظ البروتوكول لحفظ البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة البروتوكول. اختر عنصر القياس من قسم القياس. ثم لتفسير البيانات ، حدد عنصر القياس ، وانتقل إلى علامة التبويب "التحليل" في قسم القياس واختر "تحليل" ضمن قائمة التحليل لحساب الخلايا الموجودة على مسافة معينة من حافة الستيرويد.
قم بإنشاء فلتر عن طريق تحديد عامل تصفية من علامة تبويب التحليل. على سبيل المثال، اعرض فقط البيانات التي تكون فيها المسافة من حافة الكرة أقل من 100 ميكرون. لتصدير البيانات الأولية، حدد تصدير من علامة تبويب الملف ثم احفظ البيانات كنص مفصول بفواصل أو نص محدود بعلامات جدولة.
يمكن فتح هذه البيانات في برنامج جداول البيانات لمزيد من التحليل. خلية sphe الناتجة عن C 8 1 16 1. تم إصلاح خلايا الورم الميلانيني البشري التي تم نقلها مع نظام فوجي وتقسيمها.
تم إجراء التصوير متحد البؤر ل AZA الأخضر ، والذي يميز الخلايا في مرحلة SG Two M من دورة الخلية وبرتقالي بيرا ، الذي يميز الخلايا في مرحلة G الأولى. عندما تتراكب هذه الصور ، يمكن ملاحظة الميزات الرئيسية مثل النواة النخرية كما هو متوقع. تسود الخلايا الحمراء G واحدة بالقرب من هذا النواة النخرية بينما تزيد الخلايا المتكاثرة الحمراء والخضراء بطريقة متدرجة نحو الحافة الخارجية للستيرويد أو الوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية أكبر.
بعد تحليل الصور شبه الآلي ، يمكن تحديد أقنعة خلية fucci والمخطط الكروي S. تم استخدام برنامج التصوير لقياس الخلايا الحمراء والخضراء في المنطقة الداخلية أو الخارجية من الكرة الكروية S. أظهر هذا التحليل أن الخلايا الموقوقة في مرحلة واحدة يتم إثراؤها في المنطقة الداخلية بينما تسود الخلايا المتكاثرة بالقرب من حافة الستيرويد.
بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أسبوع إلى أسبوعين ، وهو إطار زمني يتضمن زراعة الستيرويد والتصوير والتحليل. بعد هذا الإجراء ، يمكن زرع الراد في مصفوفة الكولاجين ثم تصويرها عبر الفحص المجهري TimeLapse. يمكن بعد ذلك أن يخضعوا لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي ، وهذا يمكن أن يساعدنا في الإجابة على أسئلة مثل ما إذا كان الوضع في الستيرويد والوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية يمكن أن يغير الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقتين مكملتين تستفيدان من مؤشر دورة الخلية بالفلورة واليوبيكويتين (FUCCI) إلى جانب تحليل الصور وقياس انسيابية الخلايا. تم تصميم هذه التقنيات لتحديد وعزل الخلايا بناءً على حالة دورة الخلية داخل الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- بحوث السرطان
- زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد
الخلفية
- تحاكي الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد بنية الورم وبيئة الخلية الدقيقة.
- فهم حالة دورة الخلية أمر بالغ الأهمية لأبحاث السرطان.
- الثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية لا تمثل بدقة ظروف الجسم الحي.
- تعزز تقنيات القياس الانسيابي والتصوير قدرات التحليل.
هدف الدراسة
- تحديد وتوصيف الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية.
- لعزل مجموعات خلوية محددة من الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد.
- لدراسة تأثير بيئة الورم على سلوك الخلية.
الطرق المستخدمة
- مؤشر دورة الخلية بالفلورة واليوبيكويتين (FUCCI) للتصور.
- تحليل الصور لتقييم حالة دورة الخلية.
- قياس انسيابية الخلايا لعزل الخلايا.
- تحضير الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد باستخدام أروس في ألواح زراعة الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- التعرف بنجاح على الخلايا المتوقفة في G1 الداخلية والخلايا المتكاثرة الخارجية.
- تحقق التصور في الوقت الحقيقي لديناميات دورة الخلية.
- تبين عزل الخلايا الحية من مناطق محددة من الأجسام الكروية.
- ملاحظات حول كيفية تأثير بيئة الورم على حساسية الدواء والتكاثر.
الخلاصات
- توفر الطرق مقاربة قوية لدراسة بيولوجيا السرطان.
- تعزز التحليل في الوقت الحقيقي فهم سلوك الخلية في النماذج ثلاثية الأبعاد.
- يمكن لهذه التقنيات أن تفيد الاستراتيجيات العلاجية في علاج السرطان.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tumor spheroids enables mechanistic de-risking of target validation by linking cell cycle status to microenvironmental cues. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying proliferation gradients and quiescent niches relevant to drug penetration and resistance. It informs portfolio triage by identifying subpopulations most likely to drive recurrence or therapeutic escape.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping G1 arrest and proliferation to spheroid regions, clarifying pathway dependencies in hypoxic versus nutrient-rich zones.
- Operational Value: Enables isolation of live cells from defined zones for downstream functional assays, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable cell cycle readouts for compound screening, ensuring assay relevance to 3D architecture.
- Operational Value: Standardizes spatial and phenotypic outputs via image analysis, improving reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling necrosis, quiescence, and proliferation gradients observed in vivo.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking position-dependent phenotypes to microenvironmental stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of microenvironmental effects on cell cycle, proceeds to screening via standardized spheroid-based assays, and supports translational research through spatially resolved biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating cell position with cell cycle phases to clarify drug response mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable red/green cell ratios in inner/outer spheroid regions, enabling compound effect tracking.
- Analytics: Provides distance-from-edge measurements and phase-specific masks as quantitative outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling oxygen/nutrient gradients that influence cancer cell phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal tracking of cell viability, gene expression, or drug response across multiple spheroid generations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through spatial resolution of proliferation and quiescence, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and scalability via semi-automated image analysis and flow cytometry isolation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by de-risking targets based on microenvironmental responsiveness.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds that penetrate quiescent niches or target cycling cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FUCCI transduction, spheroid culture, and confocal imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis software capable of channel segmentation and morphometric filtering.
- Necessitates standardization across cell lines and matrix conditions for reproducible spheroid formation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-melanoma or stromal co-culture systems.
- Limited by sectioning depth and signal penetration in larger spheroids, affecting core region resolution.
