نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء أورجانوتيبيك 3D الميلانوما جلد كروي نموذج الذي يلخص كل بنية وتعقيد متعددة الخلايا من الجهاز/ورم في الجسم الحي ولكن وفي الوقت نفسه يلائم المنهجية التجريبية التدخل.

الهدف العام من نموذج الجلد الكروي للورم الميلانيني العضوي ثلاثي الأبعاد هو تلخيص كل من الهندسة المعمارية والتعقيد متعدد الخلايا لعضو أو ورم في الجسم الحي مع استيعاب التدخل التجريبي المنهجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الورم الميلانيني مثل التفاعل بين الورم والمضيف والتدخل العلاجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تقليد البنية ثلاثية الأبعاد للنقائل غير الوعائية في الجسم الحي.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الورم الميلانيني لأنه يعكس عدم تجانس الورم. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن جودة الخلايا الأولية حاسمة ولا يتم استخدام المضادات الحيوية أثناء عملية الخلية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الورم الميلانيني لأنه يعكس عدم تجانس الورم.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن التعامل السليم مع نموذج جلد الورم الميلانيني ثلاثي الأبعاد مهم للغاية. للبدء ، زراعة خلايا الورم الميلانيني 451LU باستخدام وسط RPMI يحتوي على 10٪ FCS ، وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا العامة. لتوليد كرويات الورم الميلانيني ، اغسل خلايا الورم الميلانيني المزروعة في PBS.

ثم أضف خمسة ملليلتر من التربسين EDTA مرة واحدة في PBS. احتضن لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف خمسة ملليلتر من RPMI تحتوي على 10٪ FCS لتحييد التربسين.

ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق لحصاد الخلايا. أعد تعليق حبيبات الخلية في RPMI التي تحتوي على 10٪ FCS.

بعد ذلك ، عد الخلايا ، وقم بتخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ، 000 خلية لكل مليلتر. استخدم ماصة إلكترونية متعددة لعمل 40 25 ميكرولتر من بقعة تعليق الخلايا على السطح الداخلي لغطاء طبق ثقافة الخلايا المعقم غير اللاصق بطول 10 سم. بعد ذلك ، اقلب الغطاء بحركة سريعة وسلسة وضعه على طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS.

استزراع أطباق القطرة المعلقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 14 يوما. بعد خمسة أيام من اكتشاف السقوط الأولي ، استخدم موزعا إلكترونيا لإضافة 10 ميكرولترات من RPMI تحتوي على 10٪ FCS لكل قطرة. بعد 10 إلى 15 يوما ، احصد الكرات عن طريق شطفها برفق من الغطاء باستخدام PBS.

اجمع الكرات الكروية في طبق زراعة خلايا طازج غير لاصق. لتوليد النظير الجلدي لإعادة بناء الجلد ، ضع ثمانية إدخالات غشائية بحجم المسام ميكرومتر في صفيحة ثقافة خلية 24 جيدا. لكل إدراج ، أعد تعليق 100،000 الخلايا الليفية في محلول تحييد الهلام.

بعد ذلك ، قم بخلط تعليق الخلايا الليفية بسرعة مع الكولاجين من النوع الأول بنسبة واحد إلى ثلاثة في حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر دون تكوين فقاعات. ثم استخدم ماصة لإضافة التعليق إلى كل إدخال. داخل غطاء معقم ، ضع الحشوات في درجة حرارة الغرفة بدون وسيط لمدة 30 دقيقة للسماح للجل الجلدي بالاستقرار.

بعد ذلك ، قم بتغطية المواد الهلامية ب DMEM واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة DMEM من المواد الهلامية الجلدية وقم بإزالة السائل منها باستخدام EGM لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية لتوليد نظير البشرة لإعادة بناء الجلد. بعد ذلك ، استخدم ماصة لإزالة EGM من المواد الهلامية.

ثم قم بزرع 100،000 خلية كيراتينية بعناية ، معلقة في 100 ميكرولتر من EGM فوق كل جل. احتضان عمليات إعادة البناء لمدة ساعة ونصف عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا الكيراتينية بالالتصاق بالجل الجلدي باستخدام طرف الماصة ، قم بإزالة الجل المتبقي بعناية من جدار الإدخال.

بعد ذلك ، قم بتغطية كل إعادة بناء ب 800 ميكرولتر من EGM والزراعة لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة الجل المتبقي بعناية من الجدار الداخلي بطرف ماصة صغير وعريض. في اليوم الثامن ، ضع الإدخالات في آبار منفصلة من ستة آبار.

بعد ذلك ، أضف 1.2 إلى 1.4 من وسط الورم الميلانيني النقيلي إلى كل بئر لتغطية قاعدة الجلد فقط لإعادة البناء. ثم احتضن لمدة 10 إلى 17 يوما عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أضف فقط 1.2 إلى 1.4 مل من وسط الورم الميلانيني النقيلي إلى كل بئر بحيث يتم تزويد إعادة بناء الجلد بوسط من قاع البئر ولكن لا يتم تغطيته بوسط.

لدمج كرويات الورم الميلانيني في النظير الجلدي لإعادة بناء الجلد بالكامل ، استخدم PBS لشطف الكرويات بعناية من غطاء طبق ثقافة الخلايا المتساقطة المعلق. لكل عملية إعادة بناء للبشرة بالكامل ، اجمع 10 إلى 20 كروية في طبق زراعة خلايا معقم غير لاصق. استخدم ماصة باستور لإزالة PBS الزائدة بعناية.

بعد ذلك ، قم بشفط الكرويات في الحد الأدنى من حجم EGM. ثم انقلها إلى الحجم المطلوب من محلول تحييد الهلام ، الذي يحتوي على 100 ، 000 من الخلايا الليفية. لكل ملحق ، امزج المعلق الكروي مع الكولاجين من النوع الأول بنسبة واحد إلى ثلاثة في حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر.

أخيرا ، قم بإنشاء إعادة بناء الجلد الكامل للنمط العضوي كما هو موضح في البروتوكول الموصوف سابقا. تتم مقارنة جلد الإنسان الطبيعي بإعادة بناء الجلد للتحقق من صحة إعادة بناء الجلد العضوي ثلاثي الأبعاد. يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين لأقسام البارافين أن الأدمة والبشرة في إعادة بناء الجلد يمكن مقارنتها بتلك الموجودة في الجلد العادي.

يتم تحليل الجلد الطبيعي وإعادة بناء الجلد البشري كيميائيا مناعيا لمقارنة تمايز البشرة. يشير التلوين المناعي ضد علامات التقسيم الطبقي للبشرة ، وهي الكيراتين 14 والكيراتين 10 والإينفولوكرين والفيلاجرين إلى مستويات مماثلة من تمايز الكيراتينسايد بين إعادة بناء الجلد والجلد الطبيعي. يشير التلوين المناعي ضد اللامينين الخامس إلى أن الصفيحة القاعدية تتشكل لربط نظرائهم في البشرة والجلد من الناحية الفسيولوجية لإعادة بناء الجلد ، على غرار الجلد العادي.

يشير تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين لقسم البارافين من إعادة بناء الجلد الكروي للورم الميلانيني إلى أن التوزيع الخلوي للورم الميلانيني الكروي يشبه التوزيع الخلوي للورم الميلانيني البشري غير الوعائي نقائل الجلد في الجسم الحي. يكشف الفحص النسيجي عن وجود مجموعة سكانية فرعية طرفية تتكاثر ومجموعة سكانية فرعية نخرية مركزية لخلايا الورم الميلانيني. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 40 يوما ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام الخلايا الأولية بأفضل جودة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لباحثي الورم الميلانيني لاستكشاف الاستجابة في المختبر في بيئة تحاكي في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج جلدي للورم الميلانيني العضوي ثلاثي الأبعاد.