على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

الهدف العام من هذا المجهر الإلكتروني واسع النطاق أو تجربة النانو هو تحديد البدائل من المستوى الجزيئي إلى مستوى الأنسجة ، في حالة اليوم ، في دماغ الزرد المتدهور. يمكن أن يساعد Nanotomy في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علوم الحياة. على سبيل المثال ، في التنكس العصبي وفي أبحاث مرض السكري من النوع 1.

الميزة الرئيسية لبضع النانو هي أنه يتم الحصول على معلومات غير متحيزة ، بدءا من الجزيئات الكبيرة والعضيات والخلايا إلى الأنسجة. وهذا يسمح بالقياس الكمي ومشاركة البيانات بحرية الوصول عبر nanotomy.org. على الرغم من أن بضع النانو يوفر نظرة ثاقبة للصيانة المناعية والخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ التنكسي العصبي لسمك الزرد ، إلا أنه يتم تطبيقه أيضا على نماذج الأمراض الأخرى ، بما في ذلك زراعة الخلايا والفأر وحتى الأنسجة البشرية.

بشكل عام ، يكافح العلماء الجدد في هذه التقنية لأن كمية البيانات هائلة. يمكن أن يكون هذا أكثر بألف مرة مما تم الحصول عليه باستخدام EM التقليدي. بعد تثبيت يرقات الزرد وفقا لبروتوكول النص ، قم بقطع رؤوس اليرقات بشكل مستقيم إلى الدماغ الخلفي لتسهيل تغلغل الأوزميوم. ضع اليرقات في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم ، 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم ، في 0.1 مولار كاكوديلات الصوديوم واحتضانها على الجليد لمدة ساعتين.

ثم استخدم الماء المقطر المزدوج لشطف الأجنة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. قبل التضمين ، يجب تجفيف العينات في سلسلة من الإيثانول. لتضمين الأجنة ، بعد احتضانها في راتنجات الايبوكسي المخففة طوال الليل وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة الراتنج المخفف واستخدم الراتنج النقي لاستبداله.

احتضن لمدة 30 دقيقة ، ثم استبدل الراتنج مرة ثانية واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد تحديث الراتنج للمرة الثالثة ، احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. ثم احتضن عند 58 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

أخيرا ، احتضن تحت ضغط منخفض في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تحت مجهر التشريح ، استخدم إبرة أو عود أسنان لتوجيه الرؤوس في قوالب التضمين المسطحة المصنوعة من السيليكون المتوفرة تجاريا. ثم بلمرة راتنجات الايبوكسي عند 58 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

عندما تصلب العينة بالكامل ، استخدم شفرات الحلاقة لتقليم الراتنج الزائد من كعب الروتين. للكشف عن الموضع الصحيح ، استخدم سكينا زجاجيا أو سكينا مسيطيا من الماس على ميكروتوم فائق الصغر لقطع أقسام اليرقات شبه الرقيقة للفوكسين الأزرق / الأساسي. انقل الأقسام شبه الرقيقة إلى شرائح مجهرية عن طريق التقاطها باستخدام ماصة باستور زجاجية تم إغلاق طرفها عن طريق صهرها في اللهب.

يجف على طبق ساخن حتى لا يتبقى الماء. بعد ذلك ، ضع العينات في 1٪ تولويدين أزرق في الماء واحتضان الأقسام على طبق ساخن لمدة 10 ثوان لتلطيخها. ثم ، بعد استخدام الماء لشطف الأقسام ، استخدم 05٪ فوكسين أساسي في 1٪ من رباعي الصوديوم لتلطيخ العينات لمدة 10 ثوان إضافية.

باستخدام مجهر ضوئي عادي من 10X إلى 40X ، افحص العينات. عند الوصول إلى الموقع أو الاتجاه الصحيح ، استخدم الهياكل التشريحية التي يمكن التعرف عليها بسهولة ، بما في ذلك الحفر الشمية أو العينين أو حدود المادة الرمادية والبيضاء ، لتحديد منطقة الدماغ محل الاهتمام أثناء التقسيم الرقيق للغاية وضبط زاوية التقسيم عند إمالة العينة. استمر في تقسيم كتلة راتنجات الايبوكسي بسكين ماسي لقطع مقاطع فائقة النحافة 70 نانومتر.

قم بتركيب كل قسم على فتحة واحدة L2 × 1 شكل شبكة نحاسية مشفرة للسماح بالاقتناء دون انقطاع بواسطة قضبان الشبكة. قد يبدو المليمتر المربع صغيرا. سوف يتناسب فقط مع الافتتاح.

بهذه الطريقة ، نمنع أشرطة الشبكة التي تحجب عينتنا. أدرك أنه سيتم تسجيل كل القطع الأثرية المقدمة في عينتنا مقارنة ب EM التقليدية. قارن العينات بالمعادن الثقيلة وفقا لبروتوكول النص وقم بتخزينها في صندوق شبكي. لتركيب العينة في المجهر الإلكتروني الماسح ، أو SEM ، ضع الشبكة من صندوق النقل مع القسم الموجود في حامل عينة الشبكة المتعددة وانقلها إلى غرفة SEM.

بعد محاذاة الكاشف وفقا لبروتوكول النص ، قم بتشعيع العينة مسبقا عن طريق التصغير بحيث تناسب المنطقة الكاملة المراد مسحها ضوئيا نافذة الصورة. بمجرد تغيير الفتحة إلى 120 ميكرومتر وإلغاء تركيز الصورة ، استخدم خيار مسح المنطقة المخفضة لجعل المنطقة الممسوحة ضوئيا ضيقة قدر الإمكان. بعد ذلك ، قم بتعيين معدل الإطارات لمسح الإطار ضوئيا في ثانية إلى ثانيتين تقريبا.

ثم قم بتكبير 100X على الأقل وامسح مساحة صغيرة لمدة 10 ثوان. إذا استمر السطوع في المنطقة في التغير ، فاستمر في التشعيع المسبق. عندما لا تغير هذه المنطقة السطوع مقارنة بمحيطها ، يكون التشعيع المسبق كافيا.

أثناء التركيز البؤري ، حدد المنطقة الأخف وزنا أو الميزة واضبط سرعة المسح الضوئي بحيث تكون التفاصيل مرئية. في برنامج المجهر ، اضبط السطوع والتباين من خلال مشاهدة الرسم البياني بعناية للحفاظ على جميع وحدات البكسل في النطاق الديناميكي. افعل الشيء نفسه مع المناطق والميزات الأكثر قتامة.

ارجع إلى المنطقة الساطعة وتحقق مرة أخرى بحيث يكون هناك بعض المساحة على جانبي الرسم البياني. بالنسبة للخطوات من الرابعة من ستة إلى أربعة ثمانية، يجب أن يتم ضبط السطوع والتباين بعناية فائقة بحيث تكون المنطقة بأكملها ضمن النطاق الديناميكي. قم بالتصغير بحيث تناسب المنطقة الكاملة المراد مسحها ضوئيا نافذة التخيل وابدأ برنامج اكتساب مساحة كبيرة.

ثم استخدم خيار المعالج لإعداد فسيفساء عن طريق تحديد منطقة من الشاشة. استخدم حجم بكسل من اثنين إلى خمسة نانومترات ، اعتمادا على التفاصيل الضرورية ، وقم بتعيين وقت مكوث يبلغ ثلاثة ميكروثانية لمسح المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو STEM. اضغط على تحسين للتحقق من إعدادات المجهر وسيتم عرض الوقت اللازم.

ثم قم بتشغيل منشئ الفحص الخارجي مرة أخرى واضغط على متابعة. لتحليل بيانات STEM ، افتح برنامج عارض ملفات EM واسع النطاق وافتح الملف المسمى معلومات الفسيفساء ، والذي سيفتح ملفات tif المتجانبة. اختر الخيار Auto Stitch Whole Mosaic واختر المعلمات التالية: وضع التداخل يساوي النصف ، وعتبة الخياطة تساوي 0.90 ، وتقليل الضوضاء يساوي تلقائيا.

إذا تعذر استيفاء معايير الخياطة، فقم بالتكبير ووضع اللوحة يدويا في موضعها وانقر فوق متابعة كما هو.تصدير البيانات كملف HTML أو كملف TIF واحد. قم بتضمين حجم البكسل النهائي واسم الملف لتمكين القياسات لاحقا ، ثم قم بتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، يكشف القطع النانوي لأقسام الدماغ الضابطة عن ميزات البنية التحتية النموذجية للأنسجة العصبية للدماغ الأمامي المنقاري بما في ذلك حزم الألياف الشمية والنوى العصبية والأجزاء الفرعية العصبية بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي.

هنا ، تشتمل الهياكل تحت الخلوية على أشكال وبؤر نووية مختلفة في أنواع الخلايا والعضيات المختلفة بما في ذلك جهاز جولجي ، والشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والحويصلات المشبكية ، وكثافات ما بعد التشابك العصبي. بشكل غير متوقع ، تكون نوى الخلايا المبطنة للبطين كثيفة الإلكترون للغاية مقارنة بالخلايا الأخرى المنتشرة بشكل جانبي في الدماغ. في الخلايا الدبقية الصغيرة ، تظهر النوى أيضا بؤر داكنة ، ربما غيرية الكروماتين ، غائبة في الخلايا الأخرى في الدماغ.

تكشف هذه الصورة من EM واسع النطاق لقسم إكليلي في يرقة الزرد التي تخضع للاستئصال العصبي عن الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة. تم العثور أيضا على السمات المميزة للخلايا الدبقية الصغيرة في خلايا الثدييات في هذه الخلايا ، بما في ذلك جهاز جولجي البارز والعديد من الشوائب مثل الجسيمات الحالة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الاستحواذ في غضون يوم واحد ، حيث سيكلفك EM التقليدي أسبوعا على الأقل.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يلعب مشغل المجهر دورا مهما في الحصول على صور عالية الجودة. هذه ليست مجرد تقنية بضغطة زر. لقد طبقنا الآن بضع النانو ليس فقط على نموذج الزرد للتنكس العصبي ، ولكننا استخدمناه أيضا لوضع العلامات المناعية للخلايا ولدراسة أنسجة الذباب والأنسجة البشرية والمزيد.

هذه التقنية تمهد الطريق لأي باحث في أي مجال. يمكنهم إعادة النظر في مجموعات البيانات عبر الإنترنت على nanotomy.org. يمكنهم بعد ذلك استكشاف التعديلات المفترضة ، بدءا من النانومتر إلى مقياس المليمتر وجميع النماذج المدروسة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق بضع النانو على سؤال البحث الخاص بك والنظام الخلوي أو الأنسجي الذي تحقق فيه. لا تنس أن المحترف فقط هو الذي يجب أن يقوم بإعداد العينة بسبب الكواشف السامة والاعتبارات الأخلاقية ، ولكن يمكن للجميع تجربة موقع الويب nanotomy. org في المنزل.