تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تكلس الأوعية الأبهرية خارج الجسم الحي (ex vivo) ونمذجة تكلس الأوعية داخل الجسم الحي (in vivo) باستخدام خلايا العضلات الملساء الأبهرية الفأرية الأولية المستنبتة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا أمراض الأوعية الدموية من خلال توفير نموذج في المختبر (in vitro) لدراسة الآليات الجزيئية لتكلس الأوعية، والسماح بتقييم تكلس الأوعية والتهاب الخلايا البلعمية داخل الجسم الحي. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح القياس الكمي الحساس وتحديد التوضع المشترك لنشاط الخلايا البلعمية مع ترسبات الكالسيوم في الآفات العصيدية حتى في المراحل المبكرة من المرض.

سيقوم روبرت تينش، وهو فني في مختبرنا، بتوضيح هذا الإجراء بالإضافة إلى كيتلين وأنا. لبدء هذا الإجراء، قم بتطهير الذيل باستخدام مسحة كحولية وحدد موقع أوردة الذيل جانبيًا. بعد ذلك، قم بتطبيق ضغط طفيف للأمام على المحقنة أثناء إدخال إبرة عيار 30 في الذيل دون مقاومة.

بعد ذلك، يتم حقن 100 µL من calcium NIR و/أو 100 µL من cathepsin NIR بمعدل ثابت. تُسحب الإبرة بعد خمس ثوانٍ، ثم تُجمع الشرايين الأبهرية بعد مرور ثلاث إلى 24 ساعة من الحقن. وباستخدام مجهر تشريحي، يتم إزالة البريتون للكشف عن أعضاء البطن.

بعد ذلك، قم بإزالة أعضاء الجهاز الهضمي مع الحرص على عدم قطع الشريان الأورطي. بعد ذلك، قم بإجراء شق جانبي في الحجاب الحاجز الأمامي وواصل الشق عبر البطن. وباستخدام مقص التشريح، قم بتحرير القفص الصدري عن طريق القطع عبر جوانب الأضلاع وإزالة الأنسجة الرخوة الملتصقة بالجزء العلوي من عظم القص.

بعد ذلك، قم بإزالة القفص الصدري لكشف الرئتين. ثم قم بإزالة الرئتين بعناية. بعد ذلك، قم بإزالة القصبة الهوائية والمريء بحذر مع التأكد من بقاء الشريان الأورطي سليمًا.

بعد ذلك، قم بإزالة الأنسجة الرخوة المحيطة بالشريان الأورطي من تفرع الشريان الحرقفي وصولاً إلى قوس الأورطي. توخَّ الحذر عند إزالة الدهون المحيطة بالأورطي. بعد ذلك، قم بإزالة ما تبقى من الدهون والأنسجة الرخوة المحيطة بالأورطي الصدري والفروع الكبيرة لقوس الأورطي.

بعد ذلك، قم بإزالة الغدة الزعترية. الآن قم بإزالة القلب من التجويف الصدري عن طريق فصله بعناية عن الأبهر القريب. ثم اقطع الأبهر القاصي عند تفرع الشريان الحرقفي.

باستخدام إبرة أنسولين، احقن محلول ملحي طبيعي في الشريان الأورطي بدءاً من قوس الأورطي لغسل ما تبقى من خلايا الدم. افصل الشريان الأورطي مع أوعية قوس الأورطي وأخرجه تماماً من الجسم. ضع الشريان الأورطي في محلول ملحي طبيعي على الثلج حتى يحين وقت التصوير.

في هذه الخطوة، ضع الشرايين الأورطية في محلول HBSS البارد حتى اكتمال عمليات التشريح. وفي غطاء زراعة أنسجة معقم، انقل الشرايين الأورطية إلى محلول الهضم الأورطي في أطباق زراعة الأنسجة مقاس 35 X 10 millimeter. بعد ذلك، قم بتحضينها عند 37 degree Celsius لمدة 30 minutes مع رج متقطع ولطيف.

بعد عملية الهضم، يجب أن يظهر الشريان الأورطي بمظهر ممتد أو منسّل. وباستخدام مجهر التشريح، قم بإزالة الطبقة الغمدية الخارجية للشريان الأورطي مع الحفاظ على سلامة الطبقة المتوسطة. وللقيام بذلك، قم بتقشير الطبقة الخارجية للشريان الأورطي من أحد طرفيه ثم انزعها عن الطبقة المتوسطة الأساسية كما تُنزع الجوارب.

بمجرد إزالة الطبقة البرانية، يتم تحضين الشريان الأورطي المتبقي في طبق زرع جديد يحتوي على وسط زرع الخلايا عند 37 degree Celsius لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات. بعد ذلك، يُقطع الشريان الأورطي إلى حلقات يتراوح عرضها من 1 إلى 2 مليمتر. تُنقل الحلقات إلى طبق زرع أنسجة جديد يحتوي على محلول هضم الشريان الأورطي، وتُحضن عند 37 degree Celsius مع رج متقطع خفيف لمدة 120 دقيقة.

أثناء الحضن، اسحب المحلول وادفعه باستخدام الماصة عدة مرات لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الدافئ إلى محلول الهضم وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 200 G. ثم اشفط الوسط وأعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب من وسط زراعة الخلايا.

لتحفيز التكلس في خلايا العضلات الملساء الوعائية، انقل الخلايا إلى طبق زراعة ذي ستة آبار واتركها حتى تلتصق. بعد ذلك، أعد تغذية الخلايا باستخدام وسط التكلس. قم بحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام على الأقل.

بعد ذلك، يتم سحب الوسط من طبق زراعة الخلايا. تُغسل الخلايا مرة واحدة بالماء المتأين. تُثبت الخلايا بوضعها في 1 mL من الفورمالين بتركيز 10% في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإزالة الفورمالين واغسل الخلايا المثبتة بالماء المقطر لمدة خمس دقائق. ثم قم بحضن الخلايا في 1 mL من محلول نترات الفضة بتركيز 5% تحت مصباح بقدرة 60 إلى 100 وات لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك، اشفط محلول نترات الفضة واغسل بالماء المقطر لمدة خمس دقائق.

بعد مرور خمس دقائق، يتم إزالة الفضة غير المتفاعلة بوضع الخلايا في 1 mL من محلول ثيوسلفات الصوديوم بتركيز 5% في ماء مقطر لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تُغسل الخلايا بالماء المقطر لمدة خمس دقائق. تصبح الخلايا المصبوغة بصبغة von Kossa الآن جاهزة للتصوير باستخدام المجهر الضوئي المقلوب القياسي.

في هذا الشكل، تم حقن فئران من النوع البري، وفئران مـُعطلة جين MGP، وفئران مـُعطلة جين LDLR بصبغتي calcium NIR وCathepsin NIR عبر حقن الوريد الذيلي، ثم تم استئصال الشرايين الأورطية بعد 24 ساعة وفحصها باستخدام التصوير الفلوري NIR. لا تظهر الفئران من النوع البري أي تكلس في الشريان الأورطي أو وجود للخلايا البلعمية تقريباً. أما الشرايين الأورطية في الفئران مـُعطلة جين LDLR فتظهر تكلسًا واسع النطاق يترافق مكانياً مع تراكم الخلايا البلعمية.

في المقابل، تعاني الفئران التي تفتقر إلى بروتين MGP من تكلس في الشريان الأورطي يحدث في غياب ارتشاح الخلايا البلعمية. في هذه التجربة، تم عزل خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) من الشريان الأورطي لفئران MGP knockout وإصابتها بفيروس غدي يعبر إما عن GFP أو MGP. أما خلايا VSMCs المعزولة من الشريان الأورطي لفئران النوع البري (wild type)، فقد تم ترانسفكشنها إما بـ siRNA عشوائي ضابط أو siRNA يستهدف MGP.

تمت زراعة الخلايا في وسط التكلس A لمدة سبعة أيام، ثم جرى تثبيتها لاحقاً وصبغها بصبغة von Kossa. وتم قياس كمية صبغ الكالسيوم باستخدام برنامج ImageJ بعد طرح الخلفية. وبعد تطويرها، مكنت هذه التقنيات العلماء من تصوير تصلب الشرايين والتكلس الوعائي خارج الجسم (ex vivo).

ولنمذجة التكلس الوعائي في المختبر. وهذا يفتح المجال لاحتمالية اختبار آثار العلاجات الدوائية المبتكرة على الأمراض الوعائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الشرايين الأورطية في خلايا العضلات الملساء الوعائية الأورطية الأولية للفئران، وتصور اللويحات العصيدية باستخدام مجسات التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة، وتصور العضلات الملساء الوعائية المتكلسة في المختبر.