تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تطوير نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للغشاء المخاطي للأمعاء البشرية المزروع تحت الجاذبية الدقيقة التي توفرها المفاعلات الحيوية للأوعية ذات الجدار الدوار. هذه الطريقة لديها إمكانات واسعة النطاق كأداة للاكتشاف في كل من الصحة والمرض. بما في ذلك التفاعلات مع مسببات الأمراض والاتجار بالمستضدات والعمليات الالتهابية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في محاكاة التنوع الظاهري للقطط واستخدام المفاعلات الحيوية للأوعية D-12 التي تسمح بالانتشار الفعال للمغذيات والأكسجين. ابدأ بفك الغطاء من منفذ تعبئة وعاء الاستزراع وإضافة 50 مل من PMI الخاص بنا. بمجرد امتلاء الوعاء ، استبدل الغطاء وامسح أي وسط مسكب بنسبة 70٪ من الإيثانول.

اترك الوعاء يحتضن لمدة 15 دقيقة على الأقل إلى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. عندما تكون جاهزا للمتابعة ، استخدم منفذ التعبئة للتخلص من وسط الاستزراع وإضافة 30 مل من وسط الاستزراع ثلاثي الأبعاد إلى الوعاء. استبدل الغطاء الموجود في منفذ التعبئة ومرة أخرى ، امسح أي وسط مسكوب بنسبة 70٪ من الإيثانول.

قم بإزالة القوارير القريبة من التقاء التي تحتوي على الخلايا البطانية للوريد السري البشري والخلايا الليفية القولونية البشرية من الحاضنة واغسلها مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، افصل الخلايا عن طريق تغطيتها باستخدام محلول 0.25٪ تريبسين مع 0.05٪ تريبسين EDTA. بمجرد فصل الخلايا ، اجمعها في أنبوب سعة 50 مليلتر محمل مسبقا ب 30 مل من DMEM يحتوي على 30٪ FBS.

الطرد المركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق لتكسير الخلايا. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 30 مل من DMEM التي تحتوي على 30٪ FBS. بعد ذلك ، قم بتخفيف 20 ميكرولترا من الخلايا المعاد تعليقها ب 20 لترا صغيرا من صبغة التريبان الزرقاء.

قم بتحميل مقياس الدم بخليط الخلية واحسب تركيز الخلايا القابلة للحياة. بعد ذلك، أعد تعليق كل نوع من أنواع الخلايا عند 50 إلى 80 مليون خلية لكل مليلتر في DMEM الذي يحتوي على 30٪ FBS. أولا ، ضع العدد المناسب من إدخالات الثقافة في آبار صفيحة من ستة آبار.

بعد ذلك ، قم بإعداد خليط الكولاجين عن طريق إضافة 10x DMEM ، و 10x Reformation Media ، و 200 ملليمولار L-glutamine و FBS المعطلة بالحرارة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم أضف الكولاجين البقري من النوع الأول ، واللامينين ، والكولاجين من النوع الرابع ، والفيبرونكتين ، وكبريتات الهيبارين ، والبروتيوغليكان ، وأخيرا أضف هيدروكسيد الصوديوم لتحييد درجة الحموضة في المحلول. إذا ظهر الخليط في أي وقت مظهرا حمضيا مصفرا ، أضف بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم العادي المعقم 1 لتحييد الخليط.

أغلق الأنبوب واخلط المحلول عن طريق قلبه عدة مرات مع تجنب تكوين الفقاعات. عند عدم الخلط ، احتفظ بالمحلول على الثلج لمنعه من البلمرة. بمجرد الخلط ، أضف معلقات الخلية إلى مستحضر الكولاجين واخلط الأنابيب عن طريق قلب الأنابيب برفق عدة مرات لتجنب تكوين الفقاعات.

ثم ضعهم مرة أخرى على الجليد. أضف أربعة إلى خمسة ملليلتر من الخلية التي تحتوي على محلول الكولاجين في كل ملحق واترك الكولاجين يتجل في الغطاء بحركة قليلة أو معدومة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، انقل صفيحة الآبار الستة إلى حاضنة لمدة ساعة إلى ساعتين إضافيتين.

بعد ذلك ، أعد اللوحة إلى غطاء مزرعة الأنسجة واستخدم زوجا من الملقط المعقم ومشرط لقطع الغشاء من الملحق بشكل معقم افصل الخلية التي تحتوي على الجل عن الغشاء ثم قم بتقطيع الجل المنفصل إلى مربعات صغيرة. أضف الخلية الصغيرة التي تحتوي على مربعات الكولاجين في أحد الأوعية المملوءة مسبقا سعة 50 مليلتر باستخدام منفذ التعبئة.

بعد ذلك ، قم بإعداد تعليق الخلايا الظهارية البشرية HCT-8 كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. أعد تعليق الخلايا بتركيز 10 ملايين خلية لكل مليلتر في DMEM الذي يحتوي على 30٪ FBS. ثم أضف ملليلتر واحد من تعليق خلية HCT-8 إلى وعاء سعة 50 مليلتر باستخدام منفذ التعبئة الخاص به.

بعد إضافة الخلايا ، أضف 20 مل إضافيا من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد في الوعاء بحيث يكون ممتلئا تقريبا. استبدل الغطاء وبلل شفة منفذ التعبئة بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، ضع حقنة سعة خمسة ملليلتر تحتوي على ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من وسط الاستزراع ثلاثي الأبعاد في منفذ واحد من الوعاء وحقنة فارغة من خمسة ملليلتر في المنفذ الآخر.

قم بإزالة أي فقاعات مرئية عن طريق السحب إلى المحقنة الفارغة بينما يتم حقن نفس الحجم تقريبا من الوسط من خلال المحقنة الأخرى في الوعاء. مع إزالة كل الهواء الآن ، ضع الأوعية في المفاعل الحيوي ، وقم بتشغيل الطاقة واضبط السرعة على 13 إلى 14 دورة في الدقيقة. اضبط السرعة حسب الضرورة لمنع الخلايا من ملامسة جدران الأوعية الدموية.

استزراع الخلايا تحت الجاذبية الدقيقة وتغيير وسط الثقافة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. لتغيير الوسائط ، استخدم طريقة الحقنة المزدوجة لاستبدال ما يقرب من 30 مل من الوسط المستخدم بوسط ثقافة ثلاثي الأبعاد جديد. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام في المزرعة ، قم بعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

ثم قم بإزالة الوعاء من المفاعل الحيوي وأضف ما يقرب من 20 مليون خلية تتكون من الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة إلى الأوعية من خلال منفذ التعبئة. ضع الأوعية مرة أخرى في المفاعل الحيوي والثقافة لمدة أربعة إلى ستة أيام إضافية. في اليوم التاسع من الثقافة ، أضف 20 مليون خلية إضافية تتكون من الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة في الوعاء واستمر في الثقافات لمدة تصل إلى 12 يوما إضافيا.

في نهاية التجربة ، استخدم ماصة نقل لحصاد كل جزء هلام صغير ، يسمى الآن البناء ، ووضعها في آبار صفيحة من ستة آبار تحتوي على 10 ملليلتر من 10٪ من الفورمالين العازلة. قم بإصلاح التركيبات لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة ثم تابع بروتوكولات التضمين والتقسيم والتلوين النسيجية القياسية. تنتج الطرق المعروضة في هذا الفيديو نموذجا عضويا ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للغشاء المخاطي للأمعاء البشرية.

في ثقافة الجاذبية الدقيقة ، تصبح الخلايا متمايزة جيدا وتشكل ميزات تشبه الزغابات مرتبة بحلول اليوم 20. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الالتزام بإرشادات زراعة الخلايا الجيدة.

من الأهمية بمكان التحكم المنهجي في الخلايا من أجل البقاء وتلوث الميكوبلازما والتغيرات في سلوك نمو الخلايا. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية من أجل تحديد علامات النسب وتمايز الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للغشاء المخاطي للأمعاء البشرية المزروعة تحت الجاذبية الصغرى.