تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تطوير نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للمخاطية المعوية البشرية يتم استنباته تحت ظروف الجاذبية الصغرى التي توفرها المفاعلات الحيوية ذات الوعاء الجداري الدوار. يمتلك هذا المنهج إمكانات واسعة كأداة للاكتشاف في كل من الحالات الصحية والمرضية، بما في ذلك التفاعلات مع الممرضات، وانتقال المستضدات، والعمليات الالتهابية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في محاكاة التنوع المظهري للقطط واستخدام المفاعلات الحيوية من طراز D-12 vessel التي تتيح انتشاراً فعالاً للمغذيات والأكسجين. ابدأ بفك الغطاء من فتحة التعبئة الخاصة بوعاء الزرع وإضافة 50 milliliters من وسط PMI الخاص بنا. وبمجرد امتلاء الوعاء، أعد تركيب الغطاء وامسح أي وسط مسكوب باستخدام 70%ethanol.

اترك الوعاء ليتخضن لمدة لا تقل عن 15 دقيقة أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. وعندما تكون مستعداً للمتابعة، استخدم منفذ التعبئة للتخلص من وسط الزرع وأضف 30 milliliters من وسط الزرع ثلاثي الأبعاد (3-D culture medium) إلى الوعاء. أعد وضع الغطاء على منفذ التعبئة، ومرة أخرى، امسح أي وسط مسكوب باستخدام 70%ethanol.

أخرج الدوارق التي تحتوي على خلايا بطانية من الوريد السري البشري وخلايا ليفية قولونية بشرية وصلت تقريباً إلى مرحلة التلاقي من الحاضنة، واغسلها مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بفصل الخلايا عن طريق تغطيتها بمحلول trypsin بتركيز 0.25% مع 0.05% trypsin EDTA. وبمجرد انفصال الخلايا، اجمعها في أنبوب سعة 50 milliliter محمل مسبقاً بـ 30 milliliters من DMEM يحتوي على 30% FBS.

قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة 10 دقائق لترسيب الخلايا. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 30 milliliters من DMEM المحتوي على 30%FBS. ثم قم بتخفيف 20 microliters من الخلايا المعاد تعليقها باستخدام 20 micro-liters من صبغة trypan blue.

قم بتعبئة مقياس كرات الدم (hemocytometer) بمزيج الخلايا واحسب تركيز الخلايا الحية. بعد ذلك، أعد تعليق كل نوع من الخلايا بتركيز يتراوح من 50 إلى 80 مليون خلية لكل مليلتر في وسط DMEM يحتوي على 30% FBS. أولاً، ضع العدد المناسب من أدوات الزرع (culture inserts) في آبار طبق سداسي الآبار.

بعد ذلك، قم بتحضير خليط الكولاجين عن طريق إضافة 10x DMEM، و10x Reconstitution Media، و200 millimolar L-glutamine، وFBS المثبط حرارياً إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. ثم أضف كولاجين بقري من النوع الأول، واللامينين، وكولاجين من النوع الرابع، والفيبرونيكتين، وهيباران سلفات بروتيوجليكان، وأخيراً أضف هيدروكسيد الصوديوم لمعادلة الرقم الهيدروجيني pH للمحلول. إذا ظهر للخليط في أي وقت مظهر حمضي مائل للاصفرار، فأضف بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم المعقم بتركيز 1 normal لمعادلة الخليط.

أغلق الأنبوب واخلط المحلول عن طريق قلبه عدة مرات مع تجنب تكوين الفقاعات. عند عدم الخلط، احتفظ بالمحلول على الثلج لمنعه من البلمرة. وبمجرد الخلط، أضف معلقات الخلايا إلى تحضير الكولاجين واخلط الأنابيب عن طريق قلبها بلطف عدة مرات لتجنب تكوين الفقاعات.

ثم أعد وضعها على الثلج. أضف من أربعة إلى خمسة ملليلتر من المحلول المحتوي على الخلايا والكولاجين في كل قطعة إدخال، واترك الكولاجين يتجلط داخل غطاء التدفق الصفائحي مع تحريك بسيط أو بدون تحريك لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة واحدة، انقل الطبق ذو الست فتحات إلى الحاضنة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين إضافيتين.

بعد ذلك، أعد الطبق إلى غطاء زراعة الأنسجة واستخدم ملقطًا معقمًا ومشرطًا لقص الغشاء من الحشوة بطريقة معقمة. افصل الهلام الذي يحتوي على الخلايا عن الغشاء، ثم قص الهلام المفصول إلى مربعات صغيرة. أضف مربعات الكولاجين الصغيرة التي تحتوي على الخلايا إلى أحد الأوعية سعة 50 milliliter المملوءة مسبقًا باستخدام منفذ التعبئة.

قم بعد ذلك بتحضير معلق من خلايا HCT-8 الظهارية البشرية كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. أعد تعليق الخلايا بتركيز 10 مليون خلية لكل milliliter في وسط DMEM يحتوي على 30% FBS. بعد ذلك، أضف 1 milliliter من معلق خلايا HCT-8 إلى الوعاء سعة 50 milliliter باستخدام فتحة التعبئة الخاصة به.

بعد إضافة الخلايا، أضف 20 milliliters إضافية من وسط الزرع ثلاثي الأبعاد (3-D culture medium) إلى الوعاء حتى يمتلئ تقريبًا. استبدل الغطاء وبلل حافة منفذ التعبئة بـ 70%ethanol. بعد ذلك، ضع محقنة سعة five milliliter تحتوي على ثلاثة إلى أربعة milliliters من وسط الزرع ثلاثي الأبعاد (3-D culture medium) في أحد منافذ الوعاء، ومحقنة فارغة سعة five milliliter في المنفذ الآخر.

قم بإزالة أي فقاعات مرئية عن طريق سحبها إلى السرنجة الفارغة بينما يتم حقن حجم مماثل تقريبًا من الوسط عن طريق السرنجة الأخرى في الوعاء. بعد إزالة جميع الهواء، ضع الأوعية في المفاعل الحيوي، ثم قم بتشغيل الطاقة واضبط السرعة على 13 إلى 14 دورة في الدقيقة. اضبط السرعة حسب الضرورة لمنع الخلايا من ملامسة جدران الوعاء.

قم باستزراع الخلايا تحت تأثير الجاذبية الصغرى وقم بتغيير وسط الاستزراع كل ثلاثة إلى أربعة أيام. ولتغيير الأوساط، استخدم طريقة السرنجة المزدوجة لاستبدال 30 milliliters تقريباً من الوسط المستخدم بوسط استزراع ثلاثي الأبعاد (3-D) جديد. وبعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الاستزراع، قم بعزل الخلايا الوحيدة ذات النواة في الدم المحيطي كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

بعد ذلك، أخرج الوعاء من المفاعل الحيوي وأضف حوالي 20 مليون خلية مكونة من الخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة إلى الأوعية عبر فتحة التعبئة. أعد الأوعية إلى المفاعل الحيوي واستمر في الزرع لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أيام إضافية. وفي اليوم التاسع تقريباً من الزرع، أضف 20 مليون خلية إضافية مكونة من الخلايا اللمفاوية والخلايا الوحيدة إلى الوعاء، وواصل عمليات الزرع لمدة تصل إلى 12 يوماً إضافياً.

في نهاية التجربة، استخدم ماصة نقل لجمع كل قطعة صغيرة من الهلام، والتي تسمى الآن "تركيباً"، وضعها في آبار صفيحة ذات ستة آبار تحتوي على 10 milliliters من محلول الفورمالين المنظم بتركيز 10%. قم بتثبيت التركيبات لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة، ثم انتقل إلى بروتوكولات التضمين والتقطيع والصباغة النسيجية القياسية. تنتج الطرق المعروضة في هذا الفيديو نموذجاً عضوياً ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للمخاطية المعوية البشرية.

في استزراع الجاذبية الصغرى، تصبح الخلايا متمايزة جيداً وتُشكل سمات منظمة تشبه الزغابات بحلول اليوم 20. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الالتزام بإرشادات استزراع الخلايا الجيدة.

من الضروري التحكم بشكل منهجي في الخلايا للتأكد من حيويتها، وخلوها من تلوث الميكوبلازما، ومراقبة التغيرات في سلوك نمو الخلايا. وباتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية لتحديد علامات السلالة والتمايز الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد متعدد الخلايا للمخاطية المعوية البشرية مستزرع تحت ظروف الجاذبية الصغرى.