الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا

يصف هذا البروتوكول منهجية الطباعة الحيوية باستخدام نظام إيداع آلي آلي يشتمل على إشارات التوجيه الطبوغرافية المحفورة مع الترسيب الدقيق للحبر الحيوي الهيدروجيل الذي يحمل الخلية. يتم تسليم الخلايا المطبوعة مباشرة إلى الميزات المحفورة وتكون قادرة على الإحساس بها والتوجيه معها.

الهدف العام من تقنية الاستغناء الآلي الآلي هذه هو إنشاء سطح لتوجيه الخلايا الطبوغرافية ثم توصيل الخلايا إلى هذه الميزات باتباع نمط مبرمج ، مما يسمح بالتحكم في سلوك الخلية وتوزيعها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الهندسة الطبية الحيوية ، مثل كيف يمكن أن تؤثر الطبولوجيا السطحية على سلوك الخلية ، سواء في الزراعة الأحادية أو في الزراعة المشتركة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستغرق وقتا أقل لبرمجة وطباعة نمط توجيه الخلية مقارنة بالطرق الأكثر رسوخا.

ويشمل أيضا خطوة تسليم الخلية للتوزيع الخاضع للرقابة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن الأنماط ثنائية الأبعاد للخلايا المودعة في الهلاميات المائية يمكن أن تستفيد من التوجيه السطحي. على هذا النحو ، قمنا بتطوير هذه التقنية لطباعة الهلاميات المائية بطريقة تتناسب مع ميزات السطح.

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام الاستغناء الآلي بمساعدة الضغط الخلفي كطابعة حيوية قائمة على النقش السطحي والبثق. لتحضير سطح البوليسترين للنقش والطباعة ، حدد لوح بوليسترين بسمك ملليمتر واحد. سوف تنحني الأوراق السميكة أكثر.

ثم عالج الورقة ببلازما الأكسجين. اضبط منظم غاز الأكسجين على شريطين. ثم قم بتشغيل آلة البلازما وتشغيل مضخة التفريغ.

تابع برمجة الماكينة بقدرة 150 واط و 30 سم مكعب قياسي في الدقيقة من تدفق غاز الأكسجين ، وقم بتعريض الورقة لهذه الظروف لمدة 10 دقائق. ثم قم بإخلاء الغرفة وأغلق الباب وابدأ الدورة. بعد ذلك ، اغمر الصفيحة المعالجة في مصل بقري الجنين النقي واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التحريض.

بعد علاج المصل ، اغسل الورقة ثلاث مرات باستخدام 1X PBS وقم بتعقيم الورقة. بعد الغسيل النهائي ، اترك الورقة في فرن 37 درجة مئوية حتى تجف طوال الليل لمدة 12 ساعة تقريبا. قم أولا بإعداد قلم الطباعة للنقش.

بعناية فائقة ، أدخل إبرة نسيجية قطرها 1.5 مم في فوهة حقنة التوزيع حتى تصبح مثبتة ومثبتة. عند محاولة إنشاء ترتيب مطبوع حيويا لأول مرة ، ارسم النمط المطلوب على ورق الرسم البياني بمحاور مرقمة لإنشاء إحداثيات x و y. ثم أدخل إحداثيات النمط في جدول بيانات.

بعد ذلك ، في برنامج الطباعة ، حدد برنامج ، إضافة برنامج ، متبوعا بتحرير ، إضافة نقطة لإنشاء البرنامج. بعد ذلك، انسخ قيم الإحداثيات x وy من جدول البيانات إلى برنامج توزيع الطباعة. قبل كل تشغيل ، قم بمعايرة الارتفاع z للروبوت لضبط موضع ملامسة القلم.

أولا ، حدد خيار الروبوت. ثم انقر فوق تغيير الوضع وقم بتمكين خيار وضع التدريس. هذا يمكن وظيفة JOG للروبوت.

لتعيين الروبوت ، ضع الروبوت أولا في موضعه الافتراضي عن طريق تحديد Robot ، Meca Initialize. ثم ، روبوت ، JOG. بعد ذلك ، في فتحتي x و y ، أدخل المسافة بالمليمترات اللازمة لوضع القلم بالضبط على أصل النمط.

بعد ذلك ، بالمليمترات أيضا ، أدخل قيمة رقمية في الفتحة z لوضع القلم أو الفوهة على اتصال بالسطح دون ثني السطح أو وضع مسافة بادئة له. يتم تعيين هذا على أنه قيمة البداية ل z. يمكن أن يختلف عمق كل أخدود باستخدام ارتفاع z.

على سبيل المثال ، يمكن أن يكون عمق الأخاديد المقطوعة 40 أو 80 أو 170 ميكرون. يتطلب الأمر تركيزا ومراقبة دقيقة للعثور على نقطة اتصال بحيث لا يكون هناك ثني للقلم أو مسافة بادئة ملحوظة على السطح. لضمان النجاح ، نوصي بإعداد عدة أوراق وتشغيل البرنامج على ارتفاع z مختلف للعثور على وضع البداية المثالي.

الخطوة التالية هي تحديد تعليمات الطباعة لكل نقطة من نقاط الإحداثيات. استخدم Start of Line Dispense لتحديد النقطة الأولى وبدء الطباعة. استخدم تمرير الخط لتعيين النقاط الوسيطة، وأخيرا، استخدم توزيع نهاية الخط للإشارة إلى الروبوت لإنهاء تشغيل الطباعة.

لتوصيل البرنامج إلى الروبوت ، حدد روبوت ، إرسال بيانات C&T. بعد ذلك ، ابدأ التشغيل عن طريق تحديد الروبوت ، وتغيير الوضع ، وتبديل وضع التشغيل وتبديل الإعداد إلى تشغيل. أخيرا ، ابدأ الطباعة.

لصنع الحبر الحيوي ، قم بإذابة 2٪ جيلاتين في Alpha MEM مكمل ب 10٪ FBS و 2٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. ضع الوسط على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للجيلاتين بالذوبان في الوسط. استزراع خلايا الحبر الحيوي إلى التقاء 70٪ في أطباق 10 سم.

يمكن استخدام أي خلايا تستجيب لميزات التوجيه السطحي ويجب أن تعبر عن ملصق الفلورسنت حتى يمكن رؤيتها أثناء عملية التضمين. حرر الخلايا المرفقة في المعلق عن طريق إزالة الوسط ، وغسل الخلايا باستخدام PBS ، وطلاء الخلايا بمحلول 1X Trypsin-EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد تحييد التربسين بوسط ، اجمع الخلايا في معلق وحبيبها عند 1 ، 000 غرام لمدة خمس دقائق.

وصف المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من الوسط. بعد قياس كثافة الخلية ، امزج المعلق في محلول الحبر الحيوي المبرد لعمل محلول بخمسة ملايين خلية لكل ملليمتر. بعد ذلك ، اسكب الحبر الحيوي الحامل للخلية في حقنة طباعة معدة محجوبة بغطاء إغراء.

قم بتبريد المحقنة المحملة إلى أربع درجات مئوية من أجل الحصول على لزوجة قابلة للطباعة. بعد ذلك ، أخرج المحقنة المحملة والمبردة ، وقم بإزالة غطاء المحقنة ، وقم بتوصيل فوهة الطباعة. بعد ذلك ، قم بتوصيل المحقنة المحملة بنظام التوزيع وقم بتوصيلها بخطوط ضغط الهواء.

من أجل طباعة الحبر الحيوي على النمط المصمم مسبقا ، يجب أن تكون الحواف والخطوط مميزة. يتم الحصول على الطباعة الدقيقة بالفعل عن طريق تحسين الضغط الخلفي للموزع ومقياس إبرة فوهة الطباعة. اضبط الضغط الخلفي للموزع على 0.05 ميجا باسكال لحقنة سعة 10 مليلتر بإبرة مدببة بمقياس 34.

بعد ذلك ، في البرنامج ، اضبط سرعة الكتابة على خمسة ملليمترات في الثانية على سطح فيلم البوليسترين. الآن ، باتباع النمط المبرمج ، قم بإيداع الحبر الحيوي الخلوي على الأخاديد المحفورة مسبقا. بعد إيداع الخلايا ، اترك الورقة تحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في وقت لاحق ، قم بتغطية سقالات الخلية المطبوعة في وسط النمو المناسب واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة حتى تلتصق الخلايا قبل إجراء مزيد من التجارب. ترسب الخلايا الجذعية التي تم زرعها عن طريق الطباعة الحيوية داخل الحبر الحيوي في النهاية على السطح واستشعرت واستطالت على طول اتجاه الخطوط المحفورة بشكل سري. الخلايا المزروعة في وسط الاستزراع دون الطباعة الحيوية محاذاة في اتجاه الميزات أيضا.

ومع ذلك ، فقد غطوا أيضا السطح بأكمله ، وبالتالي ، فإن الحبر الحيوي قيد الخلايا بالأثر المطبوع. عندما يتم زرعها على صفائح بدون ميزات محفورة ، لم تظهر الخلايا أي اتجاه أو محاذاة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حفر الأخاديد بدقة على لوح البوليسترين ثم طباعة الخلايا الحيوية بدقة في الأخاديد.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريبا. من المفيد جدا للباحثين في مجال الهندسة الحيوية الكشف عن تفاعلات سطح الخلية في النماذج التي تتطلب تباين الخلية وتحديد المواقع. لا تنس أن الحبر الحيوي يحتوي على خلايا حية ومن المهم جدا استخدام تقنية معقمة عند طباعة الأوراق.