الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter

الهدف العام من هذا الإجراء هو طباعة خلايا ليفية من نوع T three على سطح مطلي بالمصل. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الامتزاز المسبق للمصل على سطح مخصص لزراعة الأنسجة. وتتمثل الخطوة الثانية في طباعة معلق من الخلايا الليفية على السطح باستخدام جهاز التنقيط المجهري ذو التدفق المستمر، يليه تحضين الخلايا عند 37 °C لمدة ساعتين.

بعد ذلك، يتم صبغ الخلايا المطبوعة وكذلك الخلايا التي تم استزراعها من خلال زراعة الخلايا القياسية بصبغة يوديد البروبيديوم (propidium iodide) وفحصها تحت مجهر مقلوب للمقارنة. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لتقييم حيوية الخلايا وكثافتها وشكلها في نقاط زمنية محددة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الطباعة بالدبوس (pin printing)، في أن رأس الطباعة يشكل سدادة فوق السطح، مما يسمح بطباعة الخلايا أثناء غمرها في أوساط زراعة الخلايا.

في حين أن الطباعة المغمورة للخلايا مفيدة في فحص المرشحات الدوائية الجديدة من حيث السلامة والفعالية، فإن الطباعة المغمورة بشكل عام مفيدة أيضاً في تطبيقات أخرى. على سبيل المثال، يمكننا تحليل المرشحات الدوائية الجديدة مقابل شرائح نسيجية، أو يمكننا استخدامها كنموذج لأنظمة الأعضاء، مثل نموذج تروية الكبد.

بشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن دخول الهواء إلى الخطوط أثناء تحضير الطابعة وطباعة الخلايا قد يؤدي إلى موت الخلايا. للبدء، يتم إذابة خلايا NIH three T three لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في حمام مائي هزاز عند 37 درجة Celsius. ثم تُعلق الخلايا في 5 mL من الوسط الغذائي الكامل وتُفصل بجهاز الطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة الطافي الخلوي دون تعكير الراسب الخلوي. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 5 milliliters من الوسط الغذائي وانقل 10 µL من المعلق الخلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 milliliter. بعد ذلك، أضف 10 µL من صبغة tripan blue إلى المعلق الخلوي وحركه بطرف الماصة، ثم اسحب 10 µL من الخلايا المصبوغة وضعها في غرفة مقياس كرات الدم (hemocytometer).

قبل عد الخلايا بقوة تكبير 10x، قم بعد الخلايا الحية التي تشبه كرات بيضاء صغيرة في أربعة من المربعات الكبيرة التسعة. قم بعد الخلايا الحية التي لا تظهر باللون الأزرق الداكن نتيجة صبغة tripan blue فقط. احسب متوسط عدد الخلايا لكل مربع كبير، مما يعطي عدد الخلايا مضروباً في 10,000 خلية لكل ملليلتر في معلق الخلايا الأصلي.

بعد ذلك، قم بستزراع الخلايا بكثافة 100, 000 خلية لكل مليلتر وبإجمالي خمسة مليلترات في كل قارورة T 25. استزرع الخلايا حتى تصل نسبة الاندماج (confluency) إلى ما بين 70 و 80% قبل البدء في التجارب. ولتجهيز سطح الطباعة، استخدم قلماً لتحديد مستطيل بحجم رأس الطباعة على قاع طبق بوليسترين معالج لزراعة الأنسجة 12.

باستخدام الماصة، ضع 50 µL من مصل جنين البقر في المنطقة المستطيلة من طبق الآبار ووزعها على المنطقة بأكملها. اترك طبق الآبار داخل غطاء السلامة البيولوجية المعقم طوال الليل حتى تجف بقعة المصل تماماً. لبدء الطباعة المغمورة، اشطف رأس الطباعة بالماء المقطر.

بعد ذلك، املأ طبق بتري بقطر 60 مليمتر بالماء المقطر وثبّت رأس الطباعة على السطح، ثم قم بتمرير الماء المقطر عبر كل خط لمدة دقيقتين بمعدل 150 microliters في الدقيقة باستخدام مضخة نيوماتيكية. ثم تخلص من الماء الموجود في طبق بتري واملأه بماء نظيف. بعد ذلك، حرك رأس الطباعة للأعلى وللأسفل في الماء ثلاث مرات.

قم بمحاذاة رأس الطباعة ليكون في المركز فوق البقعة المغلفة بالمصل في طبق الـ 12 بئرًا المجهز مسبقًا. بعد ذلك، قم بتهيئة رأس الطباعة باستخدام محلول Prewarm. أكمل الوسط بـ 300 microliters لكل قناة.

في حالة إجراء عمليات طباعة متعددة، أضف شطفاً بالمبيض بالإضافة إلى الشطف بالماء بين كل عملية طباعة وأخرى. انتقل إلى طباعة الخلايا المعلقة على السطح بتركيز 50,000 cells per milliliter، وبمعدل 60 microliters per minute. 100 microliters لكل قناة.

بعد عملية طباعة الخلايا، ضع رأس الطباعة في وضعية الإرساء اليسرى مقابل السطح والمشعب في حاضنة زراعة الخلايا. اضبط الحاضنة على 5% carbon dioxide ودرجة حرارة من 37 degrees Celsius لمدة ساعتين. بعد فترة الحضانة التي استمرت ساعتين، قم بإزالة رأس الطباعة وضع الغطاء على طبق الزراعة.

تعتبر اللحظة التي يتم فيها إزالة رأس الطباعة هي النقطة الزمنية صفر. ولغرض المقارنة، يتم إجراء زراعة خلوية قياسية أيضاً. أضف 1 mL من الوسط الغذائي المسخن مسبقاً إلى إحدى أطباق الـ 12 بئراً التي تم وضع نقاط المصل فيها، ثم خذ 1 mL من معلق الخلايا المتبقي وانقله باستخدام الماصة إلى بئر واحد من طبق الـ 12 بئراً.

سينتج عن ذلك مستنبت يحتوي على 50,000 خلية في الطبق. ضع طبق مستنبت الخلايا في حاضنة عند 37 °C لمدة ساعتين. بعد فترة التحضين التي استغرقت ساعتين، ابدأ بحساب الوقت لضمان الاتساق بين العينات المطبوعة والعينات المستزرعة.

تعتبر هذه هي النقطة الزمنية للساعة صفر. بعد 0 و 2 و 24 و 48 ساعة، قم بتحضير الخلايا من كلتا الطريقتين للتصوير عن طريق الصبغ بـ propidium iodide، الذي يندمج فقط في نواة الخلايا الميتة. أولاً، اشطف الخلايا بلطف ثلاث مرات باستخدام 1 mL من phosphate puffed saline المحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم لإزالة أي حطام خلوي.

بعد ذلك، أضف 1 mL من وسط الزرع المسخن مسبقاً إلى كل وعاء زرع، ثم أضف 1 µL من المحلول المخزون لصبغة يوديد البروبيديوم. قم بتحضين الخلايا المصبوغة بيوديد البروبيديوم عند 37 °C لمدة 10 دقائق قبل تصوير الخلايا باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 10x و 40x. وأخيراً، تخلص من الخلايا في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة المناسبة.

تمت طباعة أو استزراع سلالة خلايا أرومة الليف، وهي خلايا NIH three T three، على سطح مغمور. وبعد الطباعة والاستزراع، تم تصوير الخلايا لتقييم الكثافة والمورفولوجيا في نقاط زمنية محددة. وأظهرت الصور أن الخلايا تمتلك أنماطاً ظاهرية متطابقة تقريباً عند كل نقطة زمنية وعند كل مستوى تكبير.

بناءً على هذه الأشكال، تبيّن أن الطباعة الفعالة كانت في حدها الأدنى. تم تقييم حيوية الخلايا باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم، وأظهرت النتائج أن حيوية الخلايا المطبوعة لم تختلف بشكل ملحوظ عن الخلايا الملقحة عند كل نقطة زمنية. ويكمن الفرق الرئيسي بين الطريقتين المستخدمتين في تثبيت الخلايا على السطح في كثافة الخلايا.

تنخفض كثافة الخلايا المطبوعة عند النقطة الزمنية لساعتين بنسبة تزيد عن 50% في كل من الخلايا المستزرعة والخلايا المطبوعة. وثمة حاجة إلى مزيد من الدراسة لتحديد سبب هذا الانخفاض. ومع ذلك، تظل نسب الكثافة المطبوعة الإجمالية أعلى بكثير عند مقارنتها بالخلايا المستزرعة.

كانت كثافة الخلايا المطبوعة في خلية التدفق أكبر بنحو 10 مرات عند كل نقطة زمنية مقارنة بالخلايا المزرعة، وذلك لأن الخلايا طُبعت بنفس كثافة الاستزراع ولكن في مساحة أصغر. وفي النقطة الزمنية النهائية، تساوت كثافة الخلايا، وهو ما يرجح أن يكون ناتجاً عن حركية الخلايا ومحدودية استهلاك الموارد. ومنذ تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات اكتشاف الأدوية لدراسة تأثيرات سمية الأدوية وفعاليتها على الخلايا، وأبحاث السرطان، وأمراض القلب، وغيرها من المجالات ذات الطلب المرتفع.

من خلال استخدام الطباعة الخلوية المغمورة بالتزامن مع تقنيات أخرى مثل الالتصاق، والالتصاق الخلوي القابل للبرمجة، يمكننا توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل الخلايا العالقة من أجل تعزيز عمليات فحص اكتشاف الأدوية وتطويرها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم راسخ لكيفية طباعة الخلايا باستخدام تقنية الطباعة المغمورة الخاصة بنا.