الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter

الهدف العام من هذا الإجراء هو طباعة ثلاثة خلايا ليفية على سطح مغطى بالمصل. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول مصل امتصاص مسبق على سطح زراعة أنسجة الأنسجة. الخطوة الثانية هي طباعة معلق من الخلايا الليفية على السطح باستخدام نصاب دقيق التدفق المستمر ، متبوعا بحضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا المطبوعة وكذلك الخلايا المزروعة من خلال زراعة الخلايا القياسية بيوديد البروبيديوم وتصورها تحت المجهر المقلوب للمقارنة. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري لتقييم صلاحية الخلية وكثافتها ومورفولوجيتها في النقاط الزمنية ذات الصلة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الطباعة بالدبوس ، هي أن رأس الطباعة يشكل ختما على السطح ، مما يسمح بطباعة الخلايا أثناء غمرها في الوسائط الخلوية.

في حين أن الطباعة المغمورة للخلايا مفيدة لفحص الأدوية الجديدة المرشحة للتأكد من سلامتها وفعاليتها ، فإن الطباعة المغمورة بشكل عام مفيدة أيضا للتطبيقات الأخرى. على سبيل المثال ، يمكننا تحليل الأدوية المرشحة الجديدة مقابل شرائح الأنسجة ، أو يمكننا استخدامها كنموذج لأنظمة الأعضاء. على سبيل المثال ، نموذج وفرة الكبد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه أثناء تحضير الطابعة والطباعة الخلوية ، لا يمكن للهواء دخول الخطوط أو يمكن أن يتسبب في موت الخلايا. لبدء إذابة الجليد ، قم بإذابة المعاهد الوطنية للصحة ، ثلاث خلايا T لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية. أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسائط الكاملة وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية للخلية دون إزعاج حبيبات الخلية. ثم أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الوسائط ونقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من اللون الأزرق إلى تعليق الخلية وحرك بطرف ماصة الماصة 10 ميكرولتر من الخلايا الملطخة في غرفة مقياس الخلوي الدموي.

قبل عد الخلايا عند تكبير 10 × ، عد الخلايا الحية التي تشبه الكرات البيضاء الصغيرة لأربعة من المربعات التسعة الكبيرة. عد فقط الخلايا الحية التي لا تظهر باللون الأزرق الداكن من البقعة الزرقاء الثلاثية. احسب متوسط عدد الخلايا لكل مربع كبير ، مما ينتج عنه عدد الخلايا مضروبا في 10،000 خلية لكل مليلتر في معلق الخلية الأصلي.

ثم خلايا البذور بكثافة 100 ، 000 خلية لكل مليلتر بإجمالي خمسة ملليلتر في كل قارورة T 25. استزراع الخلايا إلى ما بين 70 و 80٪ من الطلاقة المشتركة قبل بدء التجارب. لتحضير سطح الطباعة ، استخدم علامة لتمييز مستطيل بحجم رأس الطباعة في الجزء السفلي من البوليسترين المعالج بزراعة الأنسجة 12.

ماصة صفيحة البئر 50 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية في المنطقة المستطيلة ونشرها على المنطقة بأكملها. باستخدام الحافة ، اترك صفيحة البئر في غطاء أمان حيوي معقم طوال الليل للسماح لبقعة المصل بالجفاف تماما. لبدء الطباعة المغمورة ، اشطف رأس الطباعة بالماء المقطر.

ثم املأ طبق بتري بحجم 60 ملم بالماء المقطر وقم بإرساء رأس الطباعة على السطح ، وتدفق الماء المقطر عبر كل خط لمدة دقيقتين بمعدل 150 ميكرولتر في الدقيقة باستخدام مضخة تعمل بالهواء المضغوط. ثم تخلص من الماء من طبق بتري واملأه بالماء النظيف. بعد ذلك ، حرك رأس الطباعة لأعلى ولأسفل في الماء ثلاث مرات.

قم بإرساء مركز رأس الطباعة فوق البقعة المطلية بالمصل في لوحة 12 بئر المعدة مسبقا. ثم قم بتجهيز رأس الطباعة باستخدام Prewarm. وسائط كاملة بسعة 300 ميكرولتر لكل قناة.

في حالة إجراء مطبوعات متعددة ، أضف شطف مبيض بالإضافة إلى شطف الماء بين المطبوعات. استمر في طباعة الخلايا العالقة بتركيز 50،000 خلية لكل مليلتر على السطح ، وبمعدل 60 ميكرولتر في الدقيقة. 100 ميكرولتر لكل قناة.

بعد طباعة الخلية، ضع رأس الطباعة على السطح والمشعب في حاضنة زراعة الخلايا. اضبط على 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 إلى درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة لمدة ساعتين ، قم بإزالة رأس الطباعة وضع الغطاء على طبق الثقافة.

يعتبر الوقت الذي تتم فيه إزالة رأس الطباعة هو النقطة الزمنية لساعة الصفر. للمقارنة ، يتم أيضا إجراء زراعة الخلايا القياسية. أضف ملليلترا واحدا من وسائط التسخين إلى أحد ألواح المصل المرقطة 12 ، ثم خذ ملليلترا واحدا من تعليق الخلية المتبقي وقم بتثبيته في بئر واحد من لوحة 12 بئر.

سينتج عن ذلك ثقافة تحتوي على 50،000 خلية في الطبق. ضع صفيحة زراعة الخلايا في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة لمدة ساعتين ، ابدأ في توقيت الاتساق بين العينات المطبوعة والبذر.

تعتبر هذه النقطة الزمنية لساعة الصفر. بعد 0 2 و 24 و 48 ساعة ، قم بإعداد الخلايا من كل طريقتين للتصوير عن طريق تلطيخ يوديد البروبيديوم ، والذي يتم دمجه فقط في نواة الخلايا الميتة. أولا ، اشطف الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من محلول ملحي منتفخ الفوسفات مع الكالسيوم والمغنيسيوم لإزالة أي حطام.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسائط الاستزراع الدافئة إلى كل وعاء استزراع ، ثم ميكرولتر واحد من يوديد البروبيديوم. يحتضن محلول المخزون الخلايا الملطخة بيوديد البروبيديوم عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل تصوير الخلايا باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 10 × و 40 ×. أخيرا ، تخلص من الخلايا في حاوية بيولوجية مناسبة.

تمت طباعة خط خلايا الخلايا الليفية ، المعاهد الوطنية للصحة ، ثلاث خلايا T أو زرعها على سطح مغمور. بعد الطباعة والبذر ، تم تصور الخلايا لتقييم الكثافة والتشكل في النقاط الزمنية ذات الصلة. أظهرت الصور أن الخلايا تمتلك أنماطا ظاهرية متطابقة تقريبا في كل نقطة زمنية وعند كل تكبير.

بناء على هذه الأرقام ، تم تحديد الطباعة الفعالة لتكون ضئيلة. تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم ، وكشفت أن صلاحية الخلايا المطبوعة لم تكن مختلفة بشكل كبير عن الخلايا الجالسة في كل نقطة زمنية. الفرق الرئيسي بين طريقتي ربط الخلايا بالسطح هو كثافة الخلايا.

تنخفض كثافة الخلايا المطبوعة عند النقطة الزمنية التي تبلغ ساعتينها بأكثر من 50٪ في كل من الخلايا الجالسة والمطبوعة. هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسة لتحديد سبب هذا الانخفاض. ومع ذلك ، تظل نسب الكثافة المطبوعة الإجمالية عند مقارنتها بالمصنفة أعلى بكثير.

كانت كثافة الخلايا المطبوعة في خلية التدفق أكثر كثافة بحوالي 10 مرات في كل نقطة زمنية مثل الخلايا المصنفة التي تفكر في طباعة الخلايا بنفس كثافة البذر ، ولكن في منطقة أصغر. في النقطة الزمنية الأخيرة ، تكون الخلايا بنفس الكثافة ، وهو ما يرجع على الأرجح إلى حركة الخلية وقيود استهلاك الموارد. منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات اكتشاف الأدوية لدراسة آثار سمية الأدوية وفعاليتها على الخلايا ومساعدات السرطان وأمراض القلب وغيرها من المجالات ذات الطلب المرتفع.

باستخدام طباعة الخلايا المغمورة جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى مثل الالتصاق والتصاق الخلية القابلة للبرمجة ، يمكننا توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل الخلايا المعلقة لتوسيع اكتشاف الأدوية وفحص التطوير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم قوي لكيفية طباعة الخلايا باستخدام تقنية الطباعة المغمورة الخاصة بنا.