فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

الهدف العام من منهجية الطباعة الحيوية للموائع الدقيقة ، هو توليد بنية أنسجة الأوعية الدموية. يمكن لهذه الطريقة حل الأسئلة الرئيسية في التصنيع الحيوي للأنسجة الوعائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها متعددة الاستخدامات في توليد وعاء وعائي ثلاثي الأبعاد يتم التحكم فيه لهندسة الأنسجة الوعائية من خلال عملية بذر الخلايا الثانوية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يوفر نظرة ثاقبة لهندسة أنسجة القلب الوعائية ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على العديد من أنواع الأنسجة الأخرى مثل الكبد والجلد وحتى السرطانات. قد يكافح الأفراد العاديون الجدد في هذه الطريقة لأن إعداد الطابعة الحيوية قد لا يكون بسيطا. لبدء هذا الإجراء ، قم ببناء رأس طباعة ميكروسويدي متحد المركز مزدوج الطبقة عن طريق إدخال إبرة حادة أصغر ، تعمل ، في وسط الإبرة الحادة الأكبر ، والتي تعمل كغمد.

تأكد من أن الإبرة الأساسية بارزة من الغلاف الخارجي حوالي ملليمتر واحد. بعد ذلك ، أدخل إبرة قياس 23 في برميل الإبرة المركزية في الاتجاه العكسي. قم بعمل ثقب على جانب برميل الإبرة الخارجية وأدخل موصل معدني بحجم مطابق.

ختم مع الغراء الايبوكسي. قم بتركيب الطارد على رأس طابعة حيوية ، باستخدام حامل بولي ميثيل ميثاكريلات أو PMMA. بعد ذلك لحقن الحبر الحيوي ومحلول التشابك من خلال أنبوبين PVC بشكل فردي ، قم بتوصيل مداخل رأس الطباعة بمضخة حقنة مزدوجة القناة.

اصنع الحبر الحيوي باستخدام مزيج من الجينات ، الجلماس ، والبادئ الضوئي. مذاب في 25 ملليمولار HEPES عازلة ، تحتوي على 10٪ مصل بقري جنين أو FBS. ثم اصنع محلولا من 0.3 مولار كلوريد الكالسيوم في المخزن المؤقت HEPES الذي يحتوي على 10٪ FBS ليكون بمثابة سائل ناقل متشابك.

قبل الطباعة الحيوية مباشرة ، قم بتربسين الخلايا البطانية للوريد السري البشري أو HUVECs لمدة خمس إلى 10 دقائق. الطرد المركزي للخلايا عند 800 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في أنبوب سعة 15 مل. أعد تعليق الخلايا في الحبر الحيوي بتركيز من خمسة إلى 10 أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر عن طريق سحب الخلايا ببطء من خمس إلى 10 مرات.

بعد ذلك ، استخدم مضخة حقنة ثنائية القناة لبدء حقن الحبر الحيوي HUVECs من خلال أحدهما ، وسائل التشابك عبر القناة الأخرى بمعدل تدفق يبلغ خمسة ميكرولتر في الدقيقة. اسمح للتدفقات بالعمل باستمرار لمدة تصل إلى دقيقة واحدة حتى تستقر. بعد ذلك ، ابدأ حركة رأس الطباعة عن طريق الحفاظ على سرعة ترسيب الطابعة الحيوية بحوالي أربعة ملليمترات في الثانية.

يجب أن تؤدي هذه الطباعة الحيوية إلى هلام أيوني سريع لمكون الجينات وترسب سقالة من الألياف الدقيقة. بعد طباعة السقالة ، قم بربط مكون gelMA بخمسة إلى 10 مللي واط لكل سنتيمتر مربع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 إلى 30 ثانية لإنجاز التبلور الكيميائي. ثم قم بإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد من السقالة عن طريق شطفه برفق ب 37 درجة مئوية دافئ PBS.

استزراع هذه السقالة في وسط نمو الخلايا البطانية عند 37 درجة مئوية في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، لمدة تصل إلى 16 يوما. قم بتغيير الوسيط كل يومين على الأقل. خلال فترة الاستزراع ، راقب HUVECs تحت المجهر حتى تهاجر إلى أطراف الألياف الدقيقة للسقالات وتشكل هياكل تشبه التجويف.

ثم قم بإزالة الوسط بالكامل بعناية من المساحة داخل السقالة بقوة الشعيرات الدموية باستخدام قطعة من ورق الترشيح المعقم. أضف على الفور قطرة من التعليق من نوع الخلايا الثانوية مثل خلايا عضلة القلب أعلى السقالة ، مما يسمح للخلايا بالتسلل إلى الفضاء الخلالي بأكمله. بعد ذلك ، احتضان هذه السقالة في حاضنة لمدة 30 دقيقة إلى ساعتين ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بالألياف الدقيقة الفردية.

قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق غسل السقالة برفق باستخدام PBS. استزراع هذه السقالة في وسط مناسب حتى يتم تشكيل الأنسجة الوعائية المرغوبة. تسمح الطباعة الحيوية للموائع الدقيقة الموصوفة هنا بالطباعة الحيوية المباشرة للسقالات الليفية الدقيقة باستخدام أحبار حيوية منخفضة اللزوجة.

يمكن طباعة سقالة بحجم ستة في ستة × ستة ملليمترات مربعة < تحتوي على أكثر من 30 ألياف دقيقة ، في غضون 10 دقائق. تظهر المناظر العلوية والجانبية للصور المجهرية للسقالات السلامة الهيكلية الممتازة أثناء عملية الطباعة الحيوية. يتحقق من خلال التشابك الأيوني الفوري لمكون الجينات مع كلوريد الكالسيوم.

بعد بثق الموائع الدقيقة للحبر الحيوي ، والتشابك الأيوني والتشابك الضوئي ، حافظت HUVECs على قابلية عالية نسبيا للبقاء. تكاثرت الخلايا وهاجرت من التوزيع العشوائي في البداية في اليوم صفر ، إلى أطراف الألياف الدقيقة في اليوم 16. نضجت خلايا عضلة القلب في الفئران حديثي الولادة التي تم زرعها على السقالة وسكنت السقالة.

أظهروا تعبيرا قويا عن المؤشرات الحيوية القلبية الوظيفية. مثل الأكتينين ألفا الساركميري ، وكونيكسين 43. كشف الفحص المجهري متحد البؤر لسقالة ليفية دقيقة مطبوعة بيولوجيا ، مأهولة بخلايا عضلة القلب ، عن تعايش كل من HUVECs وخلايا عضلة القلب.

HUVECs بشكل أساسي في حدود الألياف الميركوية ، في حين أن خلايا عضلة القلب تحيط بالجزء الخارجي من الألياف الدقيقة. تمكنت الخلايا من الحفاظ على ضربها التلقائي والمتزامن لمدة تصل إلى تسعة إلى 28 يوما. اعتمادا على مصدر الخلية وتكوين السقالات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج الأنسجة الوعائية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية للموائع الدقيقة بالإضافة إلى تصنيع رأس الطباعة وعمليات الطابعة الحيوية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تصنيع رأس الطباعة وعمليات الطابعة الحيوية قد يكون أمرا صعبا للأشخاص الذين لم يستخدموا واحدة من قبل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر جعل الإبرتين متحدتي المركز في رأس الطباعة والسماح للتدفق بالاستقرار قبل بدء الطباعة الحيوية.

مع تطوير هذه التقنية ، أصبح لدى الباحثين في مجال هندسة الأنسجة والتصنيع الحيوي الآن أداة تمكينية أخرى لتوليد تركيبات الأنسجة الوعائية إما لأغراض التجديد في الجسم الحي أو لنمذجة الأنسجة في المختبر.