فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

الهدف العام من منهجية الطباعة الحيوية مائعية الموائع هذه هو إنشاء بنية نسيجية وعائية. ويمكن لهذه الطريقة حل تساؤلات رئيسية في التصنيع الحيوي للأنسجة الوعائية. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في تعدد استخداماتها في توليد وعاء وعائي ثلاثي الأبعاد يتم التحكم في شكله لهندسة الأنسجة الوعائية من خلال عملية استزراع خلوي ثانوية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يقدم رؤية حول هندسة الأنسجة القلبية الموعاة، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضاً على العديد من أنواع الأنسجة الأخرى مثل الكبد والجلد وحتى الأورام السرطانية. قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن إعداد الطابعة الحيوية قد لا يكون بسيطاً. لبدء هذا الإجراء، قم بتركيب رأس طباعة ميكروفلويديك مركزي مزدوج الطبقة عن طريق إدخال إبرة غير مدببة أصغر حجماً، تعمل كقلب، في مركز إبرة غير مدببة أكبر حجماً، تعمل كغلاف.

تأكد من بروز الإبرة المركزية من الغلاف الخارجي بنحو واحد مليمتر. بعد ذلك، أدخل إبرة مقاس 23 gauge في أسطوانة الإبرة المركزية في الاتجاه المعاكس. اصنع ثقباً في جانب أسطوانة الإبرة الخارجية وأدخل وصلة معدنية ذات حجم مطابق.

قم بالختم باستخدام غراء الإيبوكسي. ثبّت الباثق على رأس الطابعة الحيوية، باستخدام حامل من مادة بولي ميثيل ميثاكريلات أو PMMA. بعد ذلك، ومن أجل حقن الحبر الحي ومحلول التشبيك عبر أنبوبين من مادة PVC بشكل منفصل، قم بتوصيل مداخل رأس الطباعة بمضخة حقن ثنائية القنوات.

قم بتحضير الحبر الحيوي باستخدام خليط من ألجينات، وGelMA، وبادئ ضوئي. يتم الإذابة في محلول HEPES المنظم بتركيز 25 millimolar، والذي يحتوي على 10% من مصل جنين البقر أو FBS. ثم قم بتحضير محلول من كلوريد الكالسيوم بتركيز 0.3 molar في محلول HEPES المنظم الذي يحتوي على 10% FBS ليعمل كسائل حامل للربط التشابكي.

قبل البدء بالطباعة الحيوية مباشرة، قم بمعالجة الخلايا البطانية لوريد السرة البشري أو HUVECs باستخدام التريبسين لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. قم بإجراء طرد مركزي للخلايا بسرعة 80 RPM لمدة خمس دقائق في أنبوب سعة 15 ملليلتر. أعد تعليق الخلايا في الحبر الحيوي بتركيز يتراوح من 5 إلى 10 مضروبة في 10⁶ خلية لكل ملليلتر عن طريق السحب والضخ ببطء باستخدام الماصة من 5 إلى 10 مرات.

استخدم بعد ذلك مضخة محاقن ثنائية القنوات لبدء حقن الحبر الحيوي المحمل بـ HUVECs عبر إحدى القناتين، وسائل التشبيك عبر القناة الأخرى بمعدل تدفق قدره 5 µL/min. اترك التدفقات تعمل بشكل مستمر لمدة تصل إلى دقيقة واحدة حتى تستقر. بعد ذلك، ابدأ حركة رأس الطباعة من خلال الحفاظ على سرعة ترسيب الطابعة الحيوية عند حوالي 4 mm/s.

يجب أن تؤدي هذه الطباعة الحيوية إلى تخثر أيوني سريع لمكون الألجينات وترسيب سِقالة من الألياف الدقيقة. بعد طباعة السِقالة، قم بإجراء الربط التشابكي الضوئي لمكون gelMA باستخدام ضوء UV بقدرة 5 إلى 10 milliwatts لكل square centimeter لمدة 20 إلى 30 ثانية لإتمام التخثر الكيميائي. ثم قم بإزالة كلوريد الكالسيوم الزائد من السِقالة عن طريق شطفها برفق باستخدام PBS دافئ بدرجة حرارة 37 degrees Celsius.

قم باستزراع هذه السقالة في وسط نمو الخلايا البطانية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وفي تركيز 5% من حجم CO2، لمدة تصل إلى 16 يومًا. قم بتغيير الوسط مرة واحدة على الأقل كل يومين. وخلال فترة الاستزراع، راقب خلايا HUVECs تحت المجهر حتى تهاجر إلى محيط الألياف الدقيقة للسقالة وتكون هياكل تشبه اللمعة.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط بالكامل بعناية من الحيز الخلالي للسقالة باستخدام قوة الخاصية الشعرية بواسطة قطعة من ورق ترشيح معقم. أضف على الفور قطرة من معلق لنوع ثانوي من الخلايا، مثل الخلايا العضلية القلبية، فوق السقالة، مما يسمح للخلايا بالتغل في كامل الحيز الخلالي. بعد ذلك، قم بتحضين هذه السقالة في حضانة لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعتين، للسماح للخلايا بالالتصاق بالألياف الدقيقة الفردية.

قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق غسل السقالة بلطف باستخدام PBS. ازرع هذه السقالة في الوسط المناسب حتى يتكون النسيج الوعائي المطلوب. تتيح الطباعة الحيوية مائعية الموائع الموصوفة هنا الطباعة الحيوية المباشرة للسقالات الليفية الدقيقة باستخدام أحبار حيوية منخفضة اللزوجة.

يمكن طباعة سِقالة حيوية بحجم 6 × 6 × 6 مليمتر مربع تحتوي على أكثر من 30 ليفاً مجهرياً خلال 10 دقائق. وتظهر المناظر العلوية والجانبية للصور المجهرية للسقالة سلامة هيكلية ممتازة أثناء عملية الطباعة الحيوية. وقد تحقق ذلك من خلال التشابك الأيوني الفوري لمكون الألجينات مع كلوريد الكالسيوم.

بعد عملية البثق الموائعي الدقيق للحبر الحيوي، والربط التشابكي الأيوني والربط التشابكي الضوئي، حافظت خلايا HUVECs على حيوية عالية نسبياً. تكاثرت الخلايا وهاجرت من التوزيع العشوائي الأولي في اليوم صفر، إلى أطراف الألياف الدقيقة في اليوم 16. كما نضجت خلايا عضلة القلب للجراذان حديثة الولادة التي زُرعت على السقالة واستوطنتها.

أظهرت تعبيراً قوياً للمؤشرات الحيوية القلبية الوظيفية، مثل sarcomeric alpha actinin وconnexin 43. وكشف الفحص المجهري البؤري لسقالة ليفية دقيقة مطبوعة حيوياً، ومأهولة بالخلايا القلبية، عن تعايش كل من HUVECs والخلايا القلبية.

تتواجد خلايا HUVECs بشكل أساسي عند حدود الألياف الدقيقة، بينما تحيط الخلايا العضلية القلبية بالجانب الخارجي لهذه الألياف. وقد تمكنت الخلايا من الحفاظ على نبضها التلقائي والمتزامن لمدة تتراوح من تسعة إلى 28 يوماً، وذلك اعتماداً على مصدر الخلايا وتكوين السقالات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج أنسجة وعائية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية مائعة الموائع الدقيقة، بالإضافة إلى تصنيع رأس الطباعة وعمليات تشغيل الطابعة الحيوية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن تصنيع رأس الطباعة وعمليات تشغيل الطابعة الحيوية قد تكون صعبة للأشخاص الذين لم يستخدموها من قبل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر جعل الإبرتين متمركزتين في رأس الطباعة والسماح للتدفق بالاستقرار قبل بدء الطباعة الحيوية.

مع تطوير هذه التقنية، أصبح لدى الباحثين في مجال هندسة الأنسجة والتصنيع الحيوي الآن أداة تمكينية أخرى لإنتاج بنى نسيجية وعائية، إما لأغراض التجديد داخل الجسم الحي (in vivo) أو لنمذجة الأنسجة في المختبر (in vitro).