بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في مراحل مختلفة من دورة تكاثر فيروس التهاب الكبد C. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد الحمض النووي الريبي الجيني لفيروس التهاب الكبد C أولا ، وهي نسخ من تركيبات البلازميد الخطية لفيروس التهاب الكبد Cv. الخطوة الثانية هي نقل الخلايا باستخدام H-C-V-R-N-A.

بعد ذلك ، يتم طلاء الخلايا لنقاط زمنية وفحوصات مختلفة. تتمثل الخطوة الأخيرة في جمع المادة الطافية لزراعة الخلايا لقياس العيار الفيروسي وحصاد الخلايا المنقولة للبروتين والحمض النووي الريبي. في نهاية المطاف ، يتم إجراء النسخ العكسي ، ومقايسة التألق المناعي الغربي PCR وعيار التهاب الكبد C وإظهار نظام قوي لزراعة الخلايا المعدية لفيروس التهاب الكبد C.

الميزة الرئيسية لنظام زراعة خلايا فيروس التهاب الكبد C المعدي على نظام التكاثر المتماثل لفيروس التهاب الكبد C هي أنه يمكن فحص خطوات الخروج والخروج من دخول الفيروس. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فيروسات التهاب الكبد C ، مثل Vion ، والتشكل ، واستضافة تفاعل مسببات الأمراض. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تطوير اللقاح لأنها تسمح بتوصيف السلالات الفيروسية الموهنة التي يمكن تقييمها على أنها لقاح مرشح محتمل.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لفيروس التهاب الكبد C ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى في عائلة المختبر الأخضر. بشكل عام ، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة التحدي المتمثل في توليد دراسة عالية الجودة للحمض النووي الريبي الجيني لفيروس التهاب الكبد Cv. أصبحت دورة النسخ المتماثل الكاملة لفيروس التهاب الكبد C ممكنة في زراعة الخلايا بعد اكتشاف النمط الجيني الثاني A HCV التهاب الكبد الوبائي الياباني العزل واحد.

العرض المرئي للمقايسة الفيروسية أمرا بالغ الأهمية لأن الاختبار سيتطلب خبرة في كل من التقنيات الجزيئية والخلوية باستخدام فيروس خيميري داخل النمط الجيني الثاني A ، F-N-X-H-C-V و F-N-X-H-C-V فارغين لتقييم تكاثر الفيروس. خطي البلازميدات الفيروسية التي تم إنشاؤها مسبقا عن طريق الهضم باستخدام إنزيم تقييد واحد XBA في أنبوب ملليلتر. ثم عالج البلازميدات بنوكيلاز الفاصوليا لتوليد نهايات حادة.

تنقية البلازميدات المهضومة عن طريق كروماتوغرافيا تبادل الأنيونات. تحقق من سلامة البلازميد الخطي عن طريق إخضاع الحمض النووي للرحلان الكهربائي لهلام AROS. بعد ذلك ، أضف قالب الحمض النووي البلازميد الخطي إلى أنبوب 0.2 مليلتر يحتوي على T سبعة مكونات تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي لتصنيع نصوص الحمض النووي الريبي الجينومي HCV.

قم بتنقية الحمض النووي المعالج حديثا باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي. ثم تحقق من إنتاج الحمض النووي الريبي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام Agros. بعد ذلك ، حدد كمية الحمض النووي الريبي عن طريق القياس الضوئي الطيفي.

افصل الخلايا الملتصقة ذات الأساس السبع باستخدام علاج إنزيم التربسين واجمع الخلايا في شكل مخروطي سعة 50 ملليلترا. اثنان بعد إعادة التشكيل بالطرد المركزي. تعليق الحبيبات الخلية مع وسط مصل منخفض بارد بعد تكرار الطرد المركزي ، قم بتعليق الخلايا في وسط مصل منخفض مرة واحدة 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر.

بعد ذلك ، قم بخلط ما مجموعه 10 ميكروغرامات من الحمض النووي الريبي الفيروسي المنسوخ مع 400 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في جهاز بيطري للتثقيب الكهربائي مبرد مسبقا بطول 0.4 سم لتوصيل الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى الخلايا باستخدام التثقيب الكهربائي عند 270 فولت و 100 أوم و 950 فيريس صغير. عند الانتهاء ، قم بتعليق الخلايا المثقبة بالكهرباء في 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة مع 15٪ FBS في هذه المرحلة ، قم بلوحة الخلايا في كل من قارورة T 25 بحوالي 1.2 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل قارورة و 48 لوحة بئر في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر لمدة 4 48 و 96 ساعة من النقاط الزمنية. استبدل الوسائط بعد أربع إلى ثماني ساعات من التعدي بوسائط نمو جديدة مكملة ب 10٪ FBS لإزالة بقايا الخلايا الميتة من القوارير والأطباق المستزرعة.

باستخدام ماصة مصلية ، حصاد المواد الطافية لزراعة الخلايا عند 48 N 96 ساعة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. ثم قم بإزالة الحطام الخلوي من العينات التي تم جمعها عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي. قم بتخزين المواد الطافية الخالية من الخلايا عند سالب 80 درجة مئوية.

قم بتجميع الخلايا لتحليل البروتين والحمض النووي الريبي عن طريق اللطخة الغربية والنسخ العكسي كميت PCR أو R-T-Q-P-C-R في النقاط الزمنية المحددة. قم بالنسخ العكسي ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي الخلوي باستخدام إنزيم النسخ العكسي وبرايمر محدد لخيط إحساس فيروس التهاب الكبد C الذي يرتبط بالمنطقة الخمسة الأولية غير المترجمة في أنبوب 0.2 ملليلتر. قم أيضا بالنسخ العكسي F-N-X-H-C-V-R-N-A لنسخ الجينوم المعروفة باستخدام برايمر حبلا استشعار HCV باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

قم بإجراء QPCR باستخدام 50 نانوغراما من CD NA المكتوب الناتج باستخدام بادئات محددة لفيروس التهاب الكبد C وصبغة خضراء ملزمة للحمض النووي تحتوي على مزيج فائق QPCR. أستخدم الشروط التالية عند تشغيل QPCR لتحديد رقم نسخة H-C-V-R-N-A بعد QPCR. قم بحل تحلل الخلية من الحمض النووي الريبي الفيروسي المنقول في 96 ساعة.

بعد التعداء باستخدام صفحة SDS. ثم انقل البروتينات التي تم حلها في الجل إلى غشاء بولي كرمة دي فلورايد بطريقة توربو عبر مؤامرة. سد الغشاء باستخدام محلول مانع يحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم و 0.2٪ توين 20 في PBS ووضعه في وعاء.

احتضان الغشاء بجسم مضاد أحادي النسيلة الأولي للفأر و S3 عند تخفيف واحد في 1000 وبيتا أكتين عند تخفيف واحد من كل 5،000 في غرفة باردة أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، أضف الغلوبولين المناعي G المضاد للفأر الماعز المترافق إلى بيروكسيداز فجل الحصان عند تخفيف واحد من كل 5 ، 000 واكتشافه عن طريق التلألؤ الكيميائي. في هذه المرحلة ، قم بإصلاح الخلايا المنقولة H-C-V-R-N-A باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند سالب 20 درجة مئوية لمقايسة التألق المناعي.

عند الانتهاء ، اغسل الخلايا باستخدام PB S3 مرات بعد الحظر باستخدام المخزن المؤقت لحظر مقايسة التألق المناعي ، استخدم المخزن المؤقت متعدد النسيلة للأرانب المضاد ل NS خمسة جسم مضاد أساسي وجسم مضاد أحادي النسيلة للفأر مضاد ل DS RNA J اثنين عند تخفيف من واحد إلى 200 واحتضانه لمدة خمس ساعات إلى بين عشية وضحاها في غرفة باردة بأربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PB S3 مرات بعد الجسم المضاد الأساسي. ثم أضف الغلوبولين المناعي للأرانب G 4 8 8 أجسام مضادة ثانوية متعددة النسيلة والماعز المضاد للجلوبولين المناعي 5 9 4 الجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة في تخفيف واحد في 1000 واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز على الطاولة.

بعد غسل الخلايا باستخدام PB S3 مرات ، قم بتلطيخ النوى باستخدام هركس يموت وعرضها باستخدام مجهر الفلورسنت. اللوحة التالية صبغة ساذجة ، 7.5 0.1 خلايا في حوالي ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل بئر. باستخدام صفيحة 96 بئر في اليوم التالي ، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للمادة الطافية المزروعة الخالية من الخلايا التي تم حصادها من الخلايا المنقولة H-C-V-R-N-A باستخدام وسائط النمو وتلقيحها ثلاث نسخ على تدرج اللون.

7.5 0.1 خلية: قم بإصلاح الخلايا بعد 72 ساعة من الإصابة باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند سالب 20 درجة مئوية بعد إزالة الخلايا من البقعة الأمينية المجمدة لبروتين H-C-V-N-S five A باستخدام الظروف الموصوفة سابقا باستخدام المجهر الفلوري. عد NS خمسة ، بؤر خلية موجبة في البئر مع أعلى تخفيف فيروسي واحسب متوسط عدد وحدات تكوين التركيز لكل مليلتر. تم تقييم جودة البلازميد الخطي لفيروس التهاب الكبد C بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي.

تعرض H-C-V-D-N-A لبوليميراز T سبعة بواسطة T بوساطة النسخ المختبري ، مما أسفر عن منتج RNA واحد عند 9.6 كيلو قاعدة. أشارت النتائج إلى أن الفيروس من النوع البري يكرر الجينوم بكفاءة. أظهر النوع البري مستوى أعلى من واحد إلى ثلاثة سجل من تكرار الجينوم مقارنة بفيروس الاستطلاع الفارغ.

أنتج الفيروس من النوع البري بروتين NS الثلاثة المتورط في انقسام البروتين الفيروسي وتكرار الجينوم. عبر الفيروس من النوع البري أيضا عن NS خمسة بروتين و NS خمسة بروتين والحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل موضعيا في السيتوبلازم الخلوي للخلايا المنقولة من النوع البري مما يشير إلى أن قياسات عيار فيروس التكاثر الفيروسي النشط أشارت إلى أن الفيروس من النوع البري معدي وينتج أكثر من 10،000 بؤرة تشكل وحدة لكل مليلتر من الجسيمات المعدية في ست ساعات بعد التعداد. كان لكل من الفيروسات البرية والفيروسات الفارغة القطبية أنشطة لوسيفيراز متشابهة تشير إلى مستوى إدخال مماثل من التحويل.

ومع ذلك ، تمت ترجمة الحمض النووي الريبي في 48 ساعة و 96 ساعة بعد التعدين. أظهر الفيروس من النوع البري مستويات متزايدة في تكرار الجينوم مقارنة بفيروس الاستطلاع الفارغ. أنتج الفيروس من النوع البري أيضا بروتين NS الفيروسي ثلاثي.

كان للفيروس الفارغ الاستطلاع نشاط لوسيفيراز على المستوى الأساسي ، في حين أن الفيروس من النوع البري كان لديه مستوى أعلى من النسخ المتماثل من اثنين إلى ثلاثة لوغاريتم. بمجرد إتقان التهاب الكبد الوبائي TC ، يمكن إجراء المقايسات الفيروسية في غضون أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك خلايا قوية ونصوص حمض الريبي الجينومي HCV عالية الجودة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن اختبار سلالات توصيف HCV في أنظمة النماذج الحيوانية للتحقيق في اللياقة البدنية في الجسم الحي وتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة.

مهد تطوير نظام زراعة خلايا التهاب الكبد C المعدية الطريق للباحثين لاستكشاف خطوات الفيريون والتشكل والخروج الفيروسي لدورة تكرار فيروس التهاب الكبد C. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات فيروسات مختلفة لتوصيف المراحل المختلفة لدورة تكاثر فيروس التهاب الكبد الوبائي سي. لا تنس أن العمل مع فيروس التهاب الكبد الوبائي C يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ومن خلال احتياطات السلامة مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.