إعداد و في المختبر توصيف وكلاء التباين القائم Dendrimer للتصوير بالرنين المغناطيسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار إعداد وتوصيف مخلب مغناطيسي شجيري يمكن استخدامه كعامل تباين للتصوير بالرنين المغناطيسي وإثبات أدائه في تجربة التصوير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال عوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي مثل خصائص وفعالية عوامل التباين التغصنية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التحضير المريح لعامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي الفعال مع البروتين العالي ، وبالتالي ضمان توصيفه السهل.

يمكن أن تمتد هذه الطريقة نحو مزيد من التعديلات الهيكلية والتحسينات الوظيفية لعوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي التغصنية والتي تعتبر ذات أهمية كبيرة للتطبيقات المحتملة في الجسم الحي. تمتد الآثار المترتبة على البحوث الطبية الحيوية والتصوير التشخيصي حيث أن المعدل الجزيئي المرتفع لعوامل التباين التغصنية يتسبب في إطالة أوقات الاحتفاظ بالأنسجة ويعزز إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي بشكل كبير. أولا ، قم بإذابة جرام واحد من السلائف الحلقية الكبيرة DO3A إستر ثلاثي بوتيل في خمسة ملليلتر من DMF.

أضف 0.67 جرام من كربونات البوتاسيوم وحركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. أضف 0.87 جرام من ثلاثي البوتيل -2-برومو -4 4-نيتروفينيل بواتنوات في أجزاء على مدار ساعة واستمر في تقليب خليط التفاعل لمدة 18 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة DMF مع التقطير الفراغي من لمبة إلى لمبة عند 40 إلى 60 درجة مئوية.

قم بتنقية البقايا باستخدام كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا للحصول على مادة صلبة مستديرة. قم بإذابة جرام واحد من المادة الصلبة في خليط من 10 مل من الإيثانول و 150 ميكرولتر من محلول الأمونيا العادي السبعة في الميثانول. أضف 150 ملليغرام من البلاديوم على الكربون المنشط وقم بإعداد مفاعل الزجاجة في الهدرجة.

رج الخليط لمدة 16 ساعة تحت جو هيدروجين 2.5 بار. صب معلق من التراب الدياتومي في الإيثانول في قمع زجاجي متكلس قم بتصفية خليط التفاعل عبر التراب الدياتومي لإزالة محفز كربون البلاديوم. قم بإزالة المذيب من المرشح على مبخر دوار.

قم بإذابة المادة الصلبة الناتجة في 15 مل من ثنائي كلورو الميثان وأربعة مكافئات ثلاثي إيثيل أمين. لهذا ، أضف 1.3 ما يعادل الثيوفوسجين وحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. قم بإزالة المذيب من خليط التفاعل على مبخر دوار وتنقية البقايا باستخدام كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا للحصول على مونومر من نوع DOTA كمادة صلبة بنية فاتحة.

قم بإعداد 66.7 ملليغرام من تغصنات G4 PAMAM من محلول 10٪ في الميثانول عن طريق تبخير المذيب على مبخر دوار عند 40 درجة مئوية. قم بإذابة التغصنات في أربعة ملليلتر من DMF. أضف 0.105 مل من ثلاثي إيثيل أمين إلى محلول التغصنات وحركه لمدة 45 دقيقة عند 60 درجة مئوية.

ثم أضف 354 ملليغرام من المونومر في أجزاء على مدار ساعة. استمر في التقليب على حرارة 45 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قم بإزالة المذيب باستخدام التقطير الفراغي من لمبة إلى لمبة.

قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم عن طريق تدوير وسط ترشيح الهلام المحبة للدهون في الميثانول لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. اجمع كسور مليلتر واحدة باستخدام الميثانول كمادة مزوية. تحليل الكسور بواسطة TLC.

قم بإزالة المذيب من الكسور التي تحتوي على مخلب التغصني المحمي على مبخر دوار. الحصول على طيف البروتونات بالرنين المغناطيسي النووي للمركب ودمج المناطق العطرية والأليفاتية. باستخدام هذه القيم ، حدد عدد الدورات الكبيرة المحمية من نوع DOTA المقترنة بتغصنات G4 PAMAM.

لإزالة حماية المنتج ، قم بإذابة المادة الصلبة في خمسة ملليلتر من حمض الفورميك وحرك الخليط على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 36 ساعة. قم بإزالة حمض الفورميك باستخدام مبخر دوار. قم بتجميد تجفيف البقايا التي تمت إزالتها من المبخر الدوار للحصول على مخلب التغصن.

باستخدام الرنين المغناطيسي النووي للبروتون ، حدد عدد الوحدات الحلقية الكبيرة المقترنة بالتغصن. قم بإذابة المخلب المجفف بالتجميد في الماء. استخدم 0.1 مولار هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة في المحلول إلى 7.0.

أضف محلول 113 ملليغرام من كلوريد الجادولينيوم III في مليلتر واحد من الماء بقطرة إلى محلول المخلب على مدى أربع ساعات. اضبط الرقم الهيدروجيني بشكل دوري على 7.0 باستخدام 0.05 مولي هيدروكسيد الصوديوم. قلب الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، أضف 158 ملليغرام من EDTA في أجزاء على مدار أربع ساعات لتصحيح الرقم الهيدروجيني مرة أخرى إلى 7.0 حسب الحاجة. يقلب لمدة 24 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع ترشيح هلام محب للماء متوسط منتفخ في الماء.

ركز خليط التفاعل ، وقم بتحميل الخليط على العمود ، ثم قم بإزالته بالماء منزوع الأيونات. جهاز الطرد المركزي العينة المنقاة في وحدة تصفية أجهزة الطرد المركزي بثلاثة كيلودالتون لمدة 30 دقيقة عند 1 ، 800 مرة جم. كرر الترشيح حوالي خمس مرات لإزالة الجادولينيوم الزائد و EDTA.

تأكد من عدم وجود أيونات الجادولينيوم الحرة في المرشح باستخدام اختبار برتقالي الزيلينول. قم بإزالة المواد المتطايرة من العينة المفلترة وتجميد البقايا جافة للحصول على عامل التباين التغصني. تحضير محلول مخزون من DCA في الماء بتركيز يتراوح بين خمسة و 10 ملليمول.

لتحديد تركيز DCA الدقيق ، قم أولا بدمج 360 ميكرولترا من محلول المخزون مع 60 ميكرولترا من معيار D2O ومعيار ثلاثي البيوتانول. ضع 400 ميكرولتر من العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الخارجي. ضع أنبوب إدخال الرنين المغناطيسي النووي المحوري يحتوي على ثلاثي البيوتانول ومحلول مرجعي للماء في أنبوب العينة.

الحصول على طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون وقياس تحول التردد بين إشارات ثلاثي البيوتانول للمحاليل المرجعية والعينة. احسب تركيز DCA باستخدام الصيغة الموضحة ، وتصحيح ثلاثي البيوتانول المضاف في العينة. تحديد تركيز حل GdDOTA المتاح تجاريا بنفس الطريقة.

ضع حلول DCA و GdDOTA في عازلة HEPES وأدوات التحكم في المياه في مجموعتين من القوارير البلاستيكية. أغلق القوارير ذات الأغطية لضمان عدم وجود فقاعات هواء. في حقنة سعة 60 مليلتر ، قم بتحميل عينات DCA 0.01 و 0.02 مللي مولار أفقيا ، واحدة من عينات GdDOTA 0.5 و 1.0 مللي مولار واثنتين من أدوات التحكم في المياه.

كرر هذا الإجراء عن طريق تحميل المجموعة الثانية من العينات في حقنة ثانية سعة 60 مل. املأ كل حقنة بمحلول GdDOTA واحد مليمولار وقم بتغطية أطراف المحقنة. ضع إحدى المحاقن أفقيا في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي بحيث تكون العينات رأسية فيما يتعلق بالماسح الضوئي.

حرك المحاقن في منتصف الماسحة الضوئية. حدد الفحص التشريحي لوضع المحقنة في مركز المغناطيس المتساوي. ثم اضغط على زر إشارة المرور لإجراء تعديلات على معلمات المسح الأولية وبدء الفحص.

اختر طريقة التصوير بزاوية سريعة / بطيئة لإجراء التصوير المرجح T1 أو الاستحواذ السريع مع طريقة تحسين الاسترخاء لإجراء التصوير المرجح T2. استخدم فحص المترجم لتحديد شريحة إكليلية للعينات المحاذاة رأسيا. قم بتحسين التباين مع معلمات اكتساب الضوضاء والحصول على الصورة.

استخدم عائد استثمار دائري لتحديد متوسط سعة الإشارة والانحراف المعياري للخلفية ولكل عينة. احسب نسبة الإشارة إلى الضوضاء. أشار التحليل الأولي إلى أن ما معدله 49 وحدة حلقية كبيرة تم اقترافها مع G4 PAMAM dendrimer.

كما تم تحديد التركيزات وأوقات الاسترخاء الطولية والعرضية لمحاليل DCA باستخدام الرنين المغناطيسي النووي. تمت مقارنة قيم الاسترخاء التي تم الحصول عليها بمونومر GdDOTA المتاح تجاريا والمستخدم سريريا. تمت مقارنة أداء DCA أيضا بمونومر GdDOTA.

تحتوي مجموعتان من المحاليل على تركيزات جادولينيوم متشابهة كما هو محدد بعدد الوحدات الحلقية الكبيرة المترافقة والمجموعتين الأخريين لهما تركيزات جزيئية متشابهة. في تجربة التصوير المرجح T1 بتركيزات مماثلة من الجادولينيوم ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء أعلى قليلا بالنسبة ل DCA مقارنة ب GdDOTA. عندما كان للمحاليل تركيزات متشابهة بالجزيء ، كانت نسبة إشارة DCA إلى الضوضاء أكبر بحوالي ثلاث مرات من نسبة GdDOTA.

في تجربة التصوير المرجح T2 ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء في DCA أقل بكثير من نسبة GdDOTA في كلا زوجي التركيز ، لا سيما عند تركيزات DCA أعلى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي القائم على التغصن. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحضير أنواع مختلفة من عوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي المتغصنة والنانو عن طريق تعديل وحدات الجزيء وتحليلها بسهولة.

بعد إتقان هذه التقنية ، يجب أن يكون الباحثون في مجال تطوير عامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي قادرين على إعداد مجموعة من المجسات المحددة لتنفيذ دراسات وظيفية مختلفة ذات أهمية حاسمة للتصوير الجزيئي المعاصر.