تحضير وتنقية وتوصيف انثانيد المجمعات للاستخدام وكلاء والتباين للتصوير بالرنين المغناطيسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع وتنقية وتوصيف المجمعات المحتوية على اللانثانيد التي يمكن استخدامها لوضع علامات على الجزيئات البيولوجية الكبيرة. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط مادة البداية المعدنية والترابط أولا مع التحكم في درجة الحموضة في المحلول. الخطوة الثانية من الإجراء هي تنقية المركب الناتج باستخدام غسيل الكلى.

بعد ذلك ، يجب التحقق من عدم وجود معدن حر. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي توصيف خصائص المركب ذات الصلة بالتصوير. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن المجمعات المركبة ستتصرف كعوامل تباين من خلال قياسات نشاط الاسترخاء.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التصوير ، مثل ما إذا كان رقم التنسيق المائي لعامل التباين يتغير عند الارتباط بالبروتين. بشكل عام ، يحتاج الأفراد إلى هذه الطريقة سوف يكافحون لأن التحكم الصافي بعناية في الرقم الهيدروجيني سيؤدي إلى جعل LI عديم الفائدة للتعليم الحيوي. وسيكون إثبات غسيل الكلى وقياسات النشاط بودا وساشي.

طلاب الدراسات العليا من مختبري لبدء الميثامين باستخدام أملاح اللانثانيد ، قم أولا بإذابة ما يعادل واحد من الترابط في الماء لإنتاج محلول من 30 إلى 265 ملليمول. يتم استخدام الترابط Paraiso Benzyl DTPA هنا بتركيز 73 مللي مولار. بعد ذلك ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول الترابط إلى ما بين 5.5 وسبعة عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم المولاري الواحد.

في هذا الفيديو، يتم الآن استخدام 0.2 ملليلتر من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المولي الواحد لإذابة واحد أو اثنين من مكافئين من كلوريد اللانثانيد في الماء لإنتاج محلول بتركيز يتراوح بين خمسة و1000 ملليمولار. يمكن استخدام كلوريد البيوم الأوروبي أو كلوريد الجادولينيوم بتركيزات 111 ملليمول. غالبا ما يتم استخدام فائض من المعدن لدفع التهوية إلى الانتهاء وبالتالي تبسيط التنقية.

بعد ذلك ، أضف كل محلول من أملاح اللاثان إلى محلول الترابط المحضر أثناء التحريك. الآن اضبط الأس الهيدروجيني لمخاليط التفاعل الناتجة إلى ما بين 5.5 وسبعة بإضافة 0.2 مولار من هيدروكسيد الأمونيوم. هنا ، يتم استخدام ما مجموعه 0.5 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم 0.2 مولار لضبط المحلول.

إذا كان الترابط المستخدم يحتوي على مجموعات وظيفية حساسة للأحماض ، فاضبط الرقم الهيدروجيني عدة مرات خلال هذه الخطوة. تأكد من توخي الحذر عند ضبط الأس الهيدروجيني لأنه إذا أصبح المحلول أساسيا جدا ، فستصبح أي مجموعات وظيفية حساسة للقاعدة مثل إيزوثيوسيانات غير صالحة للاستخدام. للاقتران ، راقب التفاعل عن كثب عن طريق قياسات الأس الهيدروجيني.

يكتمل التفاعل عندما يظل الرقم الهيدروجيني ثابتا بالنسبة للروابط التي لا تحتوي على أي مجموعات وظيفية حساسة للقاعدة ، قد يكون العمل الذي يتضمن رفع الأس الهيدروجيني مفيدا أيضا. لبدء عمل غسيل الكلى ، حدد الطول المناسب لأنبوب غسيل الكلى للاحتفاظ بحجم العينة بالإضافة إلى الطول الإضافي لاستيعاب 10٪ إضافية من حجم العينة. ثم اتبع إرشادات الشركة المصنعة لقطع الأنبوب بهذا الطول.

في هذا الفيديو ، تم استخدام غشاء قطع الوزن الجزيئي من 100 إلى 500 دالتون ، ولكن يمكن استخدام أنابيب قطع الوزن الجزيئي الأكبر حسب الاقتضاء إذا تم إجراء الاقتران قبل الميثاب ، إذا كان ذلك مناسبا ، بناء على إرشادات الشركة المصنعة ، انقع أنبوب غسيل الكلى المقطوع والماء لمدة 15 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة. بعد ذلك ، املأ خزان غسيل الكلى بالماء ، والذي سيكون بمثابة غسيل الكلى. يتم استخدام دورق سعة لتر واحد هنا.

يجب أن يكون حجم غسيل الكلى حوالي 100 ضعف حجم العينة. الآن قم بطي أحد طرفي الأنبوب مرتين وقم بتأمين الجزء المطوي بمشبك إغلاق غسيل الكلى. لف نهاية الإغلاق بشريط مطاطي للتأكد من بقائه مغلقا أثناء غسيل الكلى.

قم بتصفية خليط التفاعل المحضر مسبقا من خلال مرشح 0.2 ميكرون. ثم قم بتحميل المرشح في الطرف المفتوح للأنبوب. الحرص على عدم تمزيق الأنبوب.

تأكد من ترك مساحة كافية للرأس لإغلاق الأنبوب. قم بطي الطرف المفتوح المتبقي من الأنبوب مرتين ، ثم قم بتثبيته بإغلاق ولف الإغلاق بشريط مطاطي. بعد ذلك ، قم بتوصيل قارورة زجاجية تحتوي على هواء بالمشبك الموجود على أحد طرفي أنبوب غسيل الكلى باستخدام شريط مطاطي آخر.

ثم قم بإرفاق قارورة تحتوي على الرمل بالمشبك الآخر. تضمن هذه القوارير بقاء الأنبوب مغمورا في غسيل الكلى. الآن ، ضع الأنبوب الكامل في خزان غسيل الكلى الذي يحتوي على غسيل الكلى.

حرك غسيل الكلى باستخدام لوحة تحريك مغناطيسية بسرعة بطيئة في درجة الحرارة المحيطة. تأكد من أن سرعة التقليب تظل بطيئة وأن المحلول لا يفعل ذلك. دوار. قم بتغيير الطلب ثلاث مرات على مدار اليوم.

في هذا الفيديو ، يتم تغيير الطلب عند 2.5 و 6.5 و 11.5 ساعة. اسمح لغسيل الكلى بالاستمرار طوال الليل لمدة 20 إلى 28 ساعة. بمجرد اكتمال غسيل الكلى ، قم بإزالة الأنبوب من القطر وافتح بعناية إغلاقا واحدا لإزالة العينة.

اغسل أنبوب غسيل الكلى ثلاث مرات بالماء واخلط الغسالات مع العينة. أخيرا ، قم بإزالة الماء من العينة تحت ضغط منخفض هنا. يتم تحقيق ذلك عن طريق التجفيف بالتجميد.

يتم تجميد العينة ثم وضعها على جهاز تجفيف بالتجميد. لتقييم وجود المعدن الحر في العينة ، قم أولا بإعداد عازلة الأسيتات عن طريق إذابة 1.4 مل من حمض الأسيتيك في 400 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.8 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم المولي ، وأضف الماء لإنتاج حجم إجمالي قدره 500 ملليلتر. ثم قم بإذابة 0.3 ملليغرام من كل مجمع في 0.3 مل من العازلة.

الآن قم بإعداد مؤشر xol البرتقالي ، والذي يجب أن يكون 16 ميكرومولار في المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 5.8. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول المؤشر هذا إلى المجمعات المعدنية الذائبة مسبقا. اكتشف وجود معدن حر من خلال ملاحظة تغير لون المؤشر من الأصفر إلى البنفسجي.

إذا رغبت في ذلك ، يمكن قياس كمية المعدن الحر عن طريق إنشاء منحنى معايرة. إذا بقي المعدن الحر ، فيجب تنقية العينة بشكل أكبر باستخدام غسيل الكلى أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء قبل التوصيف. بعد ذلك ، لتحديد رقم تنسيق الماء لعينة الأفيون ، قم بإعداد محلول حوالي ملليمولار واحد من الأفيون المحتوي على مركب في الماء ، ثم محلول آخر بنفس التركيز في أكسيد الديوتيريوم.

قبل التحليل ، يجب تبخير محلول أكسيد الديوتيريوم وإذابته في أكسيد الديوتيريوم ثلاث مرات لإزالة الماء المتبقي ، وتشغيل مقياس الفلور الطيفي ، وإضافة محلول الماء إلى vete نظيف ووضع vete في مقياس الفلور الطيفي. الآن قم بإجراء الإثارة والانبعاثات لتحديد الحد الأقصى لكل منهما عند حوالي 395 نانومتر ، 595 نانومتر على التوالي. بعد ذلك ، قم بإجراء تجربة اضمحلال وقت الفسفور باستخدام الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث المحددة للتو والمعلمات المعروضة هنا.

كرر هذه الخطوة بمحلول أكسيد الديوتيريوم المحضر من مخطط بيانات اضمحلال التلألؤ التي تم الحصول عليها للتو ، السجل الطبيعي للشدة مقابل الوقت. منحدر هذه الخطوط هو معدلات الاضمحلال. في هذا الفيديو ، تم استخدام Microsoft Excel 2007 لإنشاء مخططات السجل الطبيعية من البيانات الأولية.

استخدم معدلات الاضمحلال في المعادلة التي طورها المفتاحون وزملاء العمل الموضحة هنا. إذا كان الترابط الخاص بك يحتوي على مجموعات OH أو NH منسقة مع المعدن ، فيجب تعديل المعادلة قبل الاستخدام. لتحديد قياسات النسبية للعينة أولا ، حدد وضع التطبيق المطلوب على محلل وقت الاسترخاء ، إما T واحد أو T اثنين.

هنا ، يتم تحديد إعداد T one. بعد ذلك ، قم بإعداد سلسلة من العينات التي تحتوي على تركيزات مختلفة من اللانثانيد المحتوي على مركب في مذيب الإذعال. هنا ، يتم استخدام الماء كمذيب ومحاليل عشرة خمسة اثنان 0.5 و 1.25 و 0.625 وصفر.

يتم تحضير Millimolar. يمكن استخدام مذيبات أو مخازن مؤقتة أخرى ، ولكن من المهم استخدام المذيب كفارغ. الحجم النهائي للعينة خاص بالأداة المستخدمة.

ضع عينة في الجهاز واتركها لمدة خمس دقائق لتتوازن مع درجة حرارة الجهاز، وهي 37 درجة مئوية للوحدة المستخدمة في هذا الفيديو. حدد الآن وقت الاسترخاء بوحدات الثواني عن طريق ضبط معلمات البرنامج للحصول على منحنى أسي سلس ل T واحد أو T اثنين. كرر هذا لجميع العينات، بما في ذلك الفارغة.

الآن ، احسب معكوس قيم الاسترخاء المقاسة T واحد أو T ورسم القيمتين. تتناسب هذه القيم مقابل تركيز اللاثان ووحدات المليمولار مع المؤامرة بخط مستقيم. منحدر الخط المجهز هو نشاط الاسترخاء هو R واحد أو R اثنين ل T واحد و T اثنين على التوالي.

هنا نرى المخطط العام للوساطة والتنقية. يصور هذا المخطط الإجراء العام للميثايشن وأسباب اختيار جذور التنقية المختلفة. هنا نرى مخططا تمثيليا لاضمحلال اللمعان حيث يتم رسم السجل الطبيعي للاضمحلال مقابل الوقت ، حيث يتم استخدام منحدرات الخطوط المتولدة من منحنيات مماثلة مطلوبة لمحاليل الماء وأكسيد الديوتيريوم مع المعادلة الأولى لتحديد عدد التنسيق المائي للمجمعات المحتوية على الأفيون.

يمكن رؤية مثال تمثيلي لقياسات livity هنا مع منحدر الخط المناسب هو T واحد للعينة. بالإضافة إلى رقم تنسيق المياه وتوصيف livity الموصوف في البروتوكول ، من المهم أيضا توصيف المنتجات النهائية باستخدام التقنيات الكيميائية القياسية. يمكن الحصول على هوية المركب باستخدام أطياف الكتلة التمثيلية لقياس الطيف الكتلي التي توضح أنماط النظائر التشخيصية للمجمعات المحتوية على الجادولينيوم والأفيون موضحة هنا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الطيفي للنهاية HPLC وتحليل العناصر لتوصيف المجمعات الناتجة بشكل أكبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتنقية وتوصيف المجمعات المحتوية على اللانثانيد التي يمكن استخدامها لوضع علامات على الجزيئات البيولوجية الكبيرة.