مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

الهدف من هذه المنهجية هو التعامل مع الأنسجة الحساسة من النباتات والفطريات والفطريات ، من أجل ملاحظتها المثلى تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، أو SEM. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة عمليا بأي فطريات أو ميكروبات أو مورفوريتي ، وكيف تصيب وتستعمرها وترتبط بمضيفها. هذه التقنية في منهجيتنا المحسنة هي لإصلاح العينات ، حيث يتم استخدام mi-toh-min في النظم البيئية المائية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح لنا تصور الجوانب الرئيسية للعدوى باستخدام موارد باهظة الثمن ومتاحة بسهولة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه تم تعديل الخطوات بشكل كبير من البروتوكولات التقليدية. وتصف الطرق المنشورة الإجراءات العامة دون تفاصيل.

للبدء ، قم بإعداد الفورمول وكحول الخليك ، أو مثبت FAA في خزانة دخان مزودة بفلتر الألدهيد. في 85 جزءا من الإيثانول المشوه بنسبة 70٪ ، و 10 أجزاء من محلول الفورمالديهايد بنسبة 60٪ ، وخمسة أجزاء من حمض الخليك الجليدي. تحت خزانة الدخان ، صب مخزون FAA في حاويات فردية.

حدد النسيج الإنشائي الزهري أو الخضري لإصلاحه ، مع التأكد من عدم تضررها من الحشرات أو الفطريات أو الظروف الجوية القاسية. قم بقص الفروع وإزالة المواد غير المرغوب فيها وإيداع العينة على الفور في محلول FAA. بعد 72 إلى 96 ساعة ، اسكب إدارة الطيران الفيدرالية في وعاء بلاستيكي للتخلص الكيميائي.

اغسل العينات على الفور ثلاث مرات باستخدام 70٪ من الإيثانول الطازج لإزالة أي بقايا FAA. يمكن تخزين المواد الثابتة إلى أجل غير مسمى في 70٪ من الإيثانول. قم بتشريح العينات في طبق بتري مغطى بالإيثانول لمنع الأنسجة من الجفاف.

استخدم طبق بتري مع تغطية القاعدة بسيليكون أسود جاف لرؤية الأنسجة البيضاء المتناقضة بشكل أفضل. انقل الأنسجة إلى حاويات منفصلة ثم اغمرها في طبق بتري يحتوي على 70٪ من الإيثانول. ضع الأغطية على الحاويات وقم بإيداعها في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي يحتوي على الكثير من 70٪ من الإيثانول.

انقل المواد التي تم تشريحها من خلال سلسلة الإيثانول في برطمانات محكمة الغلق أو أنابيب أجهزة الطرد المركزي. اترك العينات في كل محلول لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم احتفظ بالعينات طوال الليل في محلول إيثانول بنسبة 100٪.

بعد سلسلة الإيثانول ، انقل الحاويات التي تحتوي على مادة إلى CPD. اكتب رقم تعريف العينة أسفل حاملي عينات SEM. ثم قم بتغطية الجزء العلوي من بذرة بشريط على الوجهين.

ضع بذرة في حامل العينات. تحت مجهر استريو ، افتح بعناية الحاويات التي تحمل العينات الصغيرة والحساسة المجففة بالفعل في CPD. ضع في اعتبارك أنه بعد علاج CPD ، تصبح العينات أخف وزنا وحساسة للكهرباء الساكنة.

أغلق الحاويات بمجرد إخراج العينات لتجنب الغبار أو الشوائب. ضع العينات على السطح اللاصق للبذرة ، وخطط مسبقا للموضع المطلوب. بمجرد أن تلمس العينات السطح ، يكون من الصعب جدا إزالتها.

لا تحاول إجراء تشريح كبير في هذه المرحلة. ما عليك سوى إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها التي يسهل التقاطها. بالنسبة لدراسات علم الحفريات ، قم بتشريح الأنثرات وافتحها لكشف حبوب اللقاح على بذرة.

احتفظ بالعينات محمية طوال الليل في وعاء محكم مع هلام السيليكا لتجنب إعادة الترطيب. قم بتغطية العينات باستخدام جهاز طلاء المراقب ونقلها إلى SEM كما هو موضح في بروتوكول النص. لاختبار النمو التفاضلي لأشواك الخراجات على أطباق بتري منفصلة ، ضع 0.5 مل من تعليق الكيس الثانوي على أسطح مختلفة.

يمكن أن تشمل الأسطح شبكات المجهر الإلكتروني لنقل الكربون والذهب والنحاس. في السابق ، كان سمك السلمون المبيض وقشور سمك النازلي ، وزلات الغطاء الزجاجي. احتضان الأكياس عند 20 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة ، مما يفضل ربط الأكياس بالسطح.

قم بإزالة السائل وأضف 0.5 مل من 2٪ جلوتارالديهايد إلى كل سطح لتثبيت الخراجات. احتفظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة تحت خزانة الدخان لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة الجلوتارالديهايد وتجفيف العينات من خلال سلسلة الإيثانول ، مع إضافة خمسة ملليلتر من كل محاليل من محاليل الإيثانول لمدة 15 دقيقة.

بمجرد الحصول على آخر محلول إيثانول بنسبة 100٪ ، يمكن تخزين العينة لمدة تصل إلى شهر في طبق بتري مغلق. انقل الشبكات والمقاييس بعناية من طبق بتري إلى حامل مناسب ل CPD يحافظ على العينات منفصلة عن بعضها البعض ، مثل حامل شبكة CPD ، أو حامل عينة التكديس. خذ الشبكة والمقاييس باستخدام الملقط ، مع الأخذ في الاعتبار أن الخراجات يجب أن تكون متجهة لأعلى على الشبكات في جميع الأوقات.

استمر في تجفيف المادة باستخدام CPD قبل إجراء تحضير عينة SEM للبويضات لمراقبة سلوكها على الأسطح المختلفة ، كما هو موضح في بروتوكول النص. لف كل عينة بعناية بورق ترشيح لتشكيل ما يقرب من 0.5 إلى سنتيمتر مربع واحد من الأظرف التي تحمل علامة قلم رصاص. احرص على عدم سحق العينات.

أغلق ورق الترشيح بمشابك الورق. ثم انقل العينات المعبأة إلى طبق بتري واغمرها في 10 مل من الماء لترطيب الأنسجة حول الجراثيم. ضع العينات على الفور في الميكروويف.

قم بإزالة المادة بمجرد أن يبدأ الماء في التبخر واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة. ثم مرر العينة من خلال سلسلة الإيثانول. اعتمادا على كمية العينة ، استخدم دورق أو أنبوب طرد مركزي لهذه الخطوة.

اترك العينات لمدة 15 دقيقة في كل محلول. بعد ذلك ، ضع العينات في CPD كما هو موضح في بروتوكول النص. لتركيب الجراثيم لمراقبة SEM ، افتح الأظرف.

ثم اجمع الجراثيم مع السطح اللزج للبذرة ، مع الحرص على عدم سحقها. أخيرا ، قم بإجراء طلاء الذهب للعينات ومراقبة SEM كما هو مفصل في بروتوكول النص. تظهر هنا براعم الأزهار من anacyclus clavatus المعالجة برباع أكسيد الأوزميوم ومحضرة باستخدام بروتوكول FAA CPD الموضح في هذا الفيديو.

تظهر أيضا عينات مجففة من phellorinia herculanea دون أي علاج ، بالإضافة إلى الجراثيم الفطرية المعالجة كما هو موضح في هذا الفيديو. يوضح هذا الشكل تطور الأزهار المبكر والمتوسط والمتأخر الذي تم التقاطه تحت SEM. هذه الصورة لأعلى منظر لشابة reh-cim.

يظهر هنا برعم زهري أثناء تمايز التثدي وزهرة عند التشريح. قد يكون من الصعب إصلاح بعض الهياكل والحفاظ عليها للتصوير تحت SEM. تشمل الأمثلة تلك القادمة من البيئات الرطبة ، وكذلك تلك التي تحتوي على زخارف ، وتلك التي تحتوي على indumenta.

تظهر هنا أنماط النمو التفاضلية لأشواك saprolegnia parasitica على قشور الزجاج والكربون والنحاس والذهب ومقاييس سمك النازلي وسمك السلمون. هذا مقطع فيديو يوضح دورة الحياة اللاجنسية ل saprolegnia parasitica. دورة الحياة اللاجنسية مهمة لتشتت هذه الكائنات الحية في بيئاتها المائية أو الرطبة.

علاوة على ذلك ، تمثل حدائق المنتجة في هذه المرحلة الوحدة الأساسية للعدوى في الأنواع الطفيلية من رتبة saprolegnials. بينما يمكن إتقان هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام ، إلا أنها يتم إجراؤها بشكل صحيح. استخدمنا المال لإكمال علاجات SEM التي توفرها للاستخدام الخارجي في هذا الإطار الزمني في الحديقة النباتية الملكية في مدريد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيعرف الباحثون كيفية جمع المواد البيولوجية الحساسة وإصلاحها بشكل فعال لمراقبة SEM. يمكن التغلب بسهولة على تدمير الخلايا أو تشويه الأعضاء أو سوء حفظ العينات من البيئات الرطبة باستخدام هذا الإجراء. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الملاحظة من خلال SEM تقتصر على دراسة التكبير العالية للأسطح.

أيضا قبل علاج CPD ، يجب الحفاظ على الأختام في مأمن من التغييرات الصادمة والتلامس المباشر مع الهواء. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم النبات لاستكشاف بنية الأبواغ أثناء العملية المعدية ، لا سيما في الأنواع التي تهم مصايد الأسماك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري للانتقال أو TM من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية وجود التركيب الداخلي لتكوين الخلية في أعضاء أو خلايا معينة ، أو حبوب اللقاح.

لا تنس أن التلاعب بالفورمالين والجلوتارالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت خزانة الدخان واستخدام الأقنعة ومعاطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.