طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام الفحص المجهري لتحليل تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية على الخيوط الخيطية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل كيفية تشكل الأغشية الحيوية البكتيرية على الخيوط ، ومدى تحديدها ، وما هي مصنوعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتحقيق في تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية على الخيوط الفطرية على نطاقات متعددة ، من نطاقات النانومتر إلى السنتيمتر.

سيتم توضيح الإجراء بواسطة كورا ميكيل جينوك من مختبري ، وكريستوف روز ، مهندس المجهر الإلكتروني من منصة INRA PTEF. للبدء ، قم بإعداد أغشية السيلوفان بنفس قطر أطباق بتري ، ثم ضعها في EDTA المغلي لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم الماء منزوع الأيونات لشطف الملاءات وتعقيمها مرتين.

لتحضير الثقافات الفطرية المسبقة ، قم بتلقيح الفطريات على وسط أجار ، مغطى بغشاء السيلوفان المعالج مسبقا EDTA. احتضان الثقافات في درجة حرارة مثالية للحصول على مستعمرات قطرها حوالي سنتيمتر واحد. من مرحلة ما قبل الزراعة ، قم بتلقيح طبق بتري من وسط أجار مناسب ، مغطى بغشاء السيلوفان EDTA باستخدام مشرط لخدش المنطقة الخارجية لمستعمرة ما قبل الزراعة برفق ، ثم نقل الخيوط إلى لوحة الأجار.

احتضان الألواح في درجة الحرارة المثلى حتى يبلغ قطر المستعمرات سنتيمترا واحدا تقريبا. لتحضير الثقافات البكتيرية مثل P.fluorescens BBc6 ، استخدم حلقة معقمة لجمع مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات بكتيرية فردية من وسط أجار ، وتلقيح 25 مل من LB. احتضان الثقافة في درجة الحرارة المثلى بين عشية وضحاها. بعد زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 5 ، 000 مرة جم لمدة ثلاث دقائق.

ثم قم بتعليق الحبيبات في 25 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار. بعد تكرار الطرد المركزي ، استخدم نفس المخزن المؤقت لضبط التركيز البكتيري النهائي إلى 10 إلى الخلايا التاسعة لكل مليلتر. املأ صفيحة صغيرة مكونة من ستة آبار بخمسة ملليلتر من المعلق البكتيري.

استخدم شفرة حلاقة معقمة لقطع غشاء السيلوفان للثقافة الفطرية إلى مربعات ، مع وجود مستعمرة واحدة على كل غشاء. ثم ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة مربعات السيلوفان التي تحتوي على خيوط بعناية من الوسط الصلب ، وانقلها إلى الآبار الفردية للتعليق البكتيري. رج الصفيحة الدقيقة برفق حتى تنفصل المستعمرات الفطرية عن السيلوفان.

ثم قم بإزالة صفائح السيلوفان ، واترك المستعمرات الفطرية في اللوحة. احتضان الصفيحة الدقيقة بتحريض لطيف عند 20 درجة مئوية لبعض الوقت اعتمادا على السلالات المستخدمة والمرحلة المراد تحليلها. بالنسبة إلى P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor ، احتضن الثقافات لمدة 30 دقيقة للحصول على أغشية حيوية في المرحلة المبكرة ، ولمدة تصل إلى 16 ساعة للأغشية الحيوية الناضجة.

لإزالة البكتيريا والبكتيريا العوالق المرتبطة إلكتروستاتيكيا بالخيوط ، اشطف الفطريات عن طريق نقلها إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من ستة آبار مملوءة بمحلول ملح قوي. رج الطبق برفق لمدة دقيقة واحدة. انقل الفطريات إلى صفيحة دقيقة جديدة مكونة من ستة آبار تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار.

رج الطبق برفق لمدة دقيقتين ، ثم انقل الفطريات إلى مخزن مؤقت جديد. مع الحفاظ على المستعمرة الفطرية في منطقة عازلة ، استخدم مشرطا لتقطيع المستعمرة إلى النصف تقريبا. انقل نصف المستعمرة المراد تلطيخها إلى طبق بتري يحتوي على ملليلتر واحد من الماء المعقم ، مع استكمال صبغة فلورية مناسبة لتصور الشبكة الفطرية ، مثل جنين القمح المتراكم مع Alexa Fluor 633.

ثم احتضان العينة في الظلام. بعد التلوين ، اشطف العينة عن طريق نقلها إلى غطاء طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم المعقم 0.1 مولار ، ورجه برفق لمدة دقيقة واحدة. اغمر نصف شريحة في غطاء طبق بتري ، وقم بوضع الجزء المقطوع بدقة ليطفو فوق الشريحة.

ثم ارفع الشريحة ببطء من المحلول العازل ، مما يسمح للعينة بالاستقرار برفق على الشريحة. الجانب الأكثر حساسية هو وضع العينة على الشريحة. لتجنب وصف الأغشية الحيوية ، يجب غمر العينة والشريحة أثناء وضع العينة ، ويجب عدم نقل العينة بعد الآن قبل التصوير.

أخيرا ، أضف 10 ميكرولترات من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى العينة ، وقم بتغطيتها بقلة غطاء زجاجي. افحص الشرائح تحت مجهر ليزر متحد البؤر بهدف 10x أو 40x. استخدم مزيجا من مسح البلاط ووظائف Z-stack للحصول على مناظر عالمية ثلاثية الأبعاد للمستعمرة الفطرية والأغشية الحيوية.

لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني ، بعد شطف الفطريات في محلول ملحي قوي كما كان من قبل ، انقل الفطريات إلى ماء معقم بدلا من المخزن المؤقت لمنع تكوين بلورات الملح أثناء خطوة الجفاف. انقل الأغشية الحيوية إلى حامل العينة ، وقم بإزالة الماء الزائد. بعد ذلك ، انقل العينات إلى غرفة المجهر الإلكتروني المسح بالضغط المتغير.

في مرحلة تبريد بلتيير ، قم بتجميد العينة إلى سالب 50 درجة مئوية ، مما يسمح لها بالتجميد ببطء مباشرة في غرفة SEM ، مع ضبط 100 باسكال من الضغط المتغير لمدة 15 ساعة. استرجع العينة وانقلها إلى نظام ترسيب فيلم عالي الفراغ. ثم قم بتغطية العينة بنانومترين من البلاتين تحت بلازما الأرجون.

راقب العينة المطلية بمجهر إلكتروني ماسح ، مع مسدس انبعاث ميداني باستخدام كاشف العدسة عالي الدقة ، وتوتر إلكتروني عالي يبلغ كيلو فولت واحد. يوضح هذا التحليل على مقياس متوسط للأغشية الحيوية التوزيع غير المتجانس للأغشية الحيوية ل P.fluorescens BBc6 باللون الأخضر على خيوط L.bicolor S238N ، كما هو موضح باللون الأحمر. أتاح التحليل أيضا تتبع تكوين الأغشية الحيوية بمرور الوقت ، من الخطوات المبكرة التي تم فيها ربط بعض البكتيريا الموسومة ب GFP فقط بالخيوط ، الموضحة باللون الأحمر ، إلى تكوين غشاء حيوي سميك وناضج.

كما هو موضح هنا ، تم استخدام الصور عالية الدقة ذات النطاق المتوسط أيضا لإجراء تحليل دقيق ، للحصول على بنى المستعمرات. بالإضافة إلى ذلك ، في هذه الدقة العالية ، إسقاط الكثافة القصوى ثنائي الأبعاد لصورة متحد البؤر ثلاثية الأبعاد ، يشير وضع العلامات المحددة مع SYPRO Ruby ، الموضح باللون الأحمر ، إلى وجود بروتينات في المصفوفة ، مع بكتيريا BBc6 المسماة GFP والفطريات المسماة FUN-1 باللون الأخضر الداكن. بعد الجفاف وترميز نفس العينة ، تم الحصول على مزيد من التفاصيل حول بنية الأغشية الحيوية عن طريق تصوير SEM.

تشير رؤوس الأسهم الخضراء إلى الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية ، وتشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى خيوط فطرية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعتين ونصف لعينة واحدة ، دون احتساب وقت الحضانة لتكوين الأغشية الحيوية وثقافة الكائنات الحية الدقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن نجاح الطريقة يعتمد بشكل كبير على القدرة على الحصول على مستعمرات فطرية رقيقة جدا ، مصنوعة من طبقات قليلة فقط من الخيوطات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل الطفرات أو التهجين في الموقع ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التوصيف الوظيفي أو الكيميائي للأغشية الحيوية ، أو لدراسة الأغشية الحيوية متعددة الأنواع. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين من مجالات متعددة مثل الطب والعلوم البيئية وصناعة الأغذية وما إلى ذلك ، لاستكشاف تكوين الأغشية الحيوية أثناء التفاعلات البكتيرية الفطرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نمو وتحليل تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية على الخيوط الفطرية.