طرق لدراسة النقل طلائي وظيفة البروتين والتعبير في الأمعاء الأصلية وكاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنمية خلايا Caco-2 المعوية في ثلاثة أبعاد وإثبات استخدام غرفة Ussing في الدراسات المتعلقة بتنظيم ناقل السيروتونين. ويمكن للطرق الموضحة هنا الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال النقل الظهاري، مثل كيفية تنظيم ناقل السيروتونين المعوي، SERT. والميزة الرئيسية لخلايا Caco-2 ثلاثية الأبعاد هي أنها تعكس التفاعلات بين الخلية والأخرى والتفاعلات بين الخلية والمصفوفة خارج الخلوية بشكل أكثر دقة من الطبقات أحادية الخلية.

تتيح تقنية غرفة Ussing قياسات دقيقة لوظيفة النقل في الظهارة المعوية. ويمتد تأثير مستنبتات Caco ثلاثية الأبعاد نحو اكتشاف العلاجات لأن هذه النماذج تمكن من فحص العوامل المضادة للأمراض المرتبطة بخلل في وظيفة النقل. ورغم أن هذه الطريقة توفر رؤية حول تنظيم ناقل السيروتونين، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على دراسات ناقلات الإلكتروليتات الأخرى مثل الصوديوم والكلوريد.

يعد العرض المرئي لهذه التقنيات أمراً بالغ الأهمية، نظراً لصعوبة تعلم عملية إزالة الطبقة المصلية العضلية وتثبيت المخاطية المعوية في غرف أوسينج (Ussing chambers). ستقوم إيشيتا تشاتيرجي، المدربة، وأنوب كومار، زميل ما بعد الدكتوراه من مجموعتنا، بتوضيح إجراءات خلايا Caco-2 ثلاثية الأبعاد. بينما ستقوم سانجيتا تياجي، أخصائية أبحاث أولى من مختبري، بتوضيح عملية إزالة الطبقة المصلية العضلية من اللفائفي لدى الفئران.

كما سيقوم كل من شوبها بريامفادا وأريفاراسو ناتاراجان، المدربان من مختبري، بتوضيح كيفية تثبيت المخاطية المقشرة وإدخالها في غرف Ussing. للبدء، يتم إذابة محلول البروتين الجيلاتيني المخفض لعامل النمو طوال الليل على الثلج في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C. وبمجرد الإذابة، يتم تحضير حصص بمقدار 1 mL أو 500 µL.

في يوم الزرع، يتم تبريد الشرائح ذات الغرف مسبقاً على الثلج. بعد ذلك، يتم إضافة 30 µL من محلول البروتين الهلامي إلى كل بئر من الشرائح الزجاجية ذات الثماني غرف وتوزيعه بالتساوي. وأثناء وضع الخليط الهلامي في الشريحة ذات الغرف أو الأطباق، يجب توخي الحذر لتجنب تكون الفقاعات لأن ذلك قد يؤدي إلى انفصال الخلايا.

ضع طبق الزرع داخل حضانة زراعة خلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة للسماح للمحلول بالتصلب. بعد ذلك، وباستخدام التريبسين، قم بفصل خلايا Caco-2 المتوافقة من قارورة الزرع. ثم، قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) وقم بطردها مركزياً عند 500 ×g عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة في وسط Caco-2 ثلاثي الأبعاد للحصول على معلق بالكثافة المطلوبة. وباستخدام معلق الخلايا الذي تم تحضيره، ازرع 4,000 خلية لكل بئر على شرائح الغرف الزجاجية واتركها تنمو لمدة تتراوح من 12 إلى 14 يومًا في حضانة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ولصبغ الخلايا، قم أولاً بشفط الوسط ثم ثبت الخلايا باستخدام 400 µL من 2% PFA.

استمر في تثبيت الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا مرتين في PBS، قم بنفاذيتها باستخدام محلول Triton بتركيز 0.5% في PBS لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة. اشطف الخلايا مرتين في محلول PBS glycine المنظم، ثم اغسل الخلايا المنفذة في IF buffer لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بحجب الخلايا باستخدام 5% normal goat serum في محلول IF buffer. بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا مع 200 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول IF buffer المضاف إليه 1% goat serum لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول IF buffer.

قم بتحضين الخلايا المغسولة مع 200 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف في منظم IF المضاف إليه 1% goat serum لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا بمنظم IF ثلاث مرات لمدة عشر دقائق. لفصل الغرفة عن الشريحة الزجاجية، ضع الشريحة أولاً في حامل قاعدة الشرائح، ثم مرر الرافع الأبيض عبر الحامل حتى يلامس حافة الآبار.

اسحب الحجرة برفق لإزالتها من الشريحة. استخدم صندوقاً أسود مغطىً لحماية الشرائح من الضوء. قم بتثبيت الشرائح باستخدام وسط بطيء التلاشي (anti-fade medium) وغطِّها بـأغطية شرائح (cover slips).

بعد ترك الشرائح لتجف لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بتغطيتها بطلاء الأظافر قبل التصوير. اعزل اللفائفي للفأر باتباع الإجراء الموضح في البروتوكول النصي. ثم استخدم المقص لفتح الأمعاء طولياً.

يُحضن مقطع النسيج الناتج في محلول KBR المنظم المبرد بالثلج والذي يحتوي على 1 µM من مادة indomethacin لمدة عشر دقائق. يتم تثبيت مقطع معوي بطول سنتيمتر واحد تقريباً، بحيث يكون الجانب المخاطي للأسفل، على لوحة تحتوي على طبقة بسمك 0.5 cm من agarose بتركيز 7% أو مطاط السيليكون المعالج. وباستخدام مجهر تشريحي ستيريو ذو إضاءة سفلية، يتم إزالة الطبقات المصلية العضلية.

بعد ذلك، يتم قص الطبقة المصلية العضلية باستخدام شفرة مشرط ريشية. استخدم ملقطاً دقيقاً لرفع حافة الطبقة على طول المحور الطولي للأمعاء. وأخيراً، ثبّت المخاطية بعناية على دبابيس المنزلقة.

أمسك النسيج المخاطي المقشر من الحواف لتجنب تمزقه. وأثناء تثبيت المخاط اللفائفي المقشر على دبابيس المنزلق، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع تمزق النسيج عند رؤوس الدبابيس وتقليل تلف حواف النسيج. وقبل معالجة النسيج، قم بتحضير محلول Krebs المشبع بغاز 95%oxygen و5%carbon dioxide.

بعد ذلك، صب المحلول في غرفة Ussing. أضف 10 micromolars من الجلوكوز كركيزة طاقة إلى الحمام المصلِي، و 10 micromolar من المانيتول للحفاظ على التوازن الاسموزي في الحمام المخاطي. لاحقاً، أدخل المنزلق الذي يحتوي على المخاطية المثبتة في الغرفة لتعريض كلا الجانبين القمي والقاعدي للنسيج لمحلول Krebs.

قم بموازنة نسيج اللفائفي في الحوض لمدة عشر دقائق. بعد ذلك، قم بمعالجة الجانب القمي مسبقاً بـ 10 micromolar من الفلوكسيتين لمدة 30 دقيقة لقياس التدفق من الغشاء المخاطي إلى الغشاء المصلّي. وأخيراً، قم بمعالجة الجانب القاعدي الجانبي للنسيج بـ 10 nanograms per milliliter من TGF beta 1 لمدة ساعة واحدة، ثم قم بحضن الجانب القمي بـ 20 nanomolar من 5-HT المسمى بالتريتيوم لمدة 30 دقيقة.

لحساب معدلات التدفق من الغشاء المخاطي إلى الغشاء المصلّي، يتم جمع حصص قدرها 0.75 milliliter من الخزان المصلّي، واستبدالها بأحجام مماثلة من وسط الحمام لمنع حدوث فروق في الضغط الهيدروستاتيكي عبر الغشاء المخاطي. ولتقدير كمية 5-HT المسمى بالتريتيوم المتراكمة في النسيج، يتم إزالة الغشاء المخاطي من الشريحة المنزلقة. يُغسل مرة واحدة بمحلول KRB المنظم المبرد بالثلج ثم يوضع في أنبوبة زراعة زجاجية.

يتم تحضين المخاطية في 0.5 milliliters من 10%KOH طوال الليل عند 37 degrees Celsius لتحليل الأنسجة. بعد ذلك، يتم قياس النشاط الإشعاعي في أجزاء حجمها 150 microliter من نواتج التحليل في ثلاث مكررات باستخدام عداد وميضي سائل. وباستخدام طريقة Bradford، يتم قياس تركيز البروتين في أجزاء حجمها من ثلاثة إلى خمسة microliter من نواتج التحليل.

يظهر هنا أكياس Caco-2 التي نمت في مستنبت ثلاثي الأبعاد ومصبوغة للأكتين، وأكياس Caco-2 ثلاثية الأبعاد المصبوغة في وقت واحد للأكتين والنوى وبروتين SERT. يظهر SERT في الغشاء اللمعي وفي الحجرات تحت القمية. ولتأكيد ميزة كرات Caco-2 ثلاثية الأبعاد مقارنة بطبقات Caco-2 أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد، تم إجراء تحليل لطخة ويسترن للتعبير عن بروتين SERT.

أظهرت النتائج تعزيز تعبير بروتين SERT في كرات Caco-2 ثلاثية الأبعاد مقارنة بخلايا Caco-2 ثنائية الأبعاد. وأخيراً، استُخدم نظام غرفة Ussing لإظهار أن TGF beta يزيد من التدفق من الغشاء المخاطي إلى الغشاء المصلي، مما يعكس زيادة امتصاص 5-HT من الغشاء اللمعي وتعزيز تراكم 5-HT الملحوظ في مخاطية اللفائفي. وتدعم هذه النتائج الحساسية الملحوظة لامتصاص 5-HT تجاه العلاج بـ fluoxetine، وهو ما يتوافق مع تعبير SERT على الغشاء اللمعي.

بمجرد إتقان هذه التقنية الخاصة بفصل وتثبيت مخاطية اللفائفي، يمكن إكمال العملية في غضون 15 دقيقة. وعند اعتماد هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التحضير المعوي خارج الجسم تكون حيويته محدودة بعد إزالته من الحيوان، وقد يستمر لمدة تصل إلى ثلاث ساعات. ويمكن استخدام كيسات Caco-2 ثلاثية الأبعاد في دراسات متنوعة، مثل أحداث نقل الغشاء، أو التعبير الجيني، أو التفاعل بين البروتينات للناقلات الظهارية.

بعد تطويرها، تمهد تقنية Caco-2 ثلاثية الأبعاد الطريق للباحثين في مجال النقل المعوي لاستكشاف حركة السوائل ودراسة الفسيولوجيا المرضية للأمراض المعوية. لا تنسَ أن العمل بالمواد المشعة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية واتباع إجراءات التطهير المناسبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستتمكن من زراعة خلايا Caco-2 في مستنبتات ثلاثية الأبعاد واستخدام هذه المستنبتات لاستقصاء تعبير الناقلات الظهارية.

ستتمكن أيضاً من استخدام غرفة أوسينج (Ussing chamber) لدراسة وظيفة نقل السيروتونين في أمعاء الفئران الأصلية.