طرق لدراسة النقل طلائي وظيفة البروتين والتعبير في الأمعاء الأصلية وكاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D

الهدف العام من هذا البروتوكول هو زراعة خلايا Caco-2 المعوية في ثلاثة أبعاد وإثبات استخدام غرفة Ussing في الدراسات التي أجريت على تنظيم ناقل السيروتونين. يمكن للطرق الموضحة هنا الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النقل الظهاري ، مثل كيفية تنظيم ناقل السيروتونين المعوي ، SERT. الميزة الرئيسية ل 3D Caco-2 هي أنها تعكس تفاعلات المصفوفة من خلية إلى خلية ومن خلية إلى أخرى بشكل أكثر دقة من الطبقات الأحادية.

وتتيح تقنية غرفة Ussing قياسات دقيقة لوظيفة النقل في ظهارة الأمعاء. الآثار المترتبة على 3D ، تمتد ثقافات Caco نحو اكتشاف العلاجات لأن هذه النماذج تمكن من فحص العوامل ضد الأمراض المرتبطة بوظيفة النقل المتغيرة. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لتنظيم ناقل السيروتونين ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسات ناقلات الإلكتروليت الأخرى مثل الصوديوم والكلوريد.

يعد العرض المرئي لهذه التقنيات أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم تجريد الطبقة المصلية العضلية وتركيب الغشاء المخاطي للأمعاء في غرف أوسينغ. سيظهر إجراءات خلية 3D Caco-2 إيشيتا تشاترجي ، المدرب ، وألوب كومار ، زميل ما بعد الدكتوراه من مجموعتنا. ستظهر سانجيتا تياجي ، أخصائية أبحاث أولى من مختبري ، تجريد الطبقة المصلية العضلية من الدقاق الفأري.

كما سيظهر تركيب الغشاء المخاطي المجرد وإدخالها في غرف أوسينغ شوبها بريامفادا وأريفاراسو ناتاراجان ، مدربان من مختبري. للبدء ، قم بإذابة عامل النمو الذي قلل محلول البروتين الجيلاتيني طوال الليل على الثلج في ثلاجة أربع درجات مئوية. بمجرد إذابتها ، قم بإعداد مليلتر واحد ، أو 500 ميكرولتر من الكميات الصغيرة.

في يوم الثقافة ، قم بتبريد الشرائح ذات الغرف على الجليد. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من محلول البروتين الجيلاتيني إلى كل بئر من الشريحة الزجاجية المكونة من ثماني بئر ووزعها بالتساوي. أثناء طلاء الخليط الجيلاتيني في شريحة الغرفة أو الألواح ، يجب توخي الحذر لتجنب تكوين الفقاعات حيث قد تنفصل الخلايا.

ضع الطبق المزروع داخل حاضنة زراعة الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة للسماح للمحلول بالتصلب. بعد ذلك ، باستخدام التربسين ، افصل خلايا Caco-2 المتجمعة عن قارورة المزرعة. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا في مقياس الدم وقم بطردها عند 500 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في وسط 3D Caco-2 للحصول على تعليق الكثافة المطلوبة. باستخدام معلق الخلية المحضر ، قم بزرع 4 ، 000 خلية لكل بئر على شرائح الغرفة الزجاجية والسماح لها بالنمو لمدة 12 إلى 14 يوما في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. لتلطيخ الخلايا ، قم أولا بشفط الوسط وقم بإصلاح الخلايا ب 400 ميكرولتر من 2٪ PFA.

استمر في تثبيت الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا مرتين في PBS ، قم بنفغلها بمحلول تريتون 0.5٪ في PBS لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة. اشطف الخلايا مرتين في المخزن المؤقت PBS glycine ثم اغسل الخلايا المنفذة في المخزن المؤقت IF لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بسد الخلايا باستخدام مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪ في المخزن المؤقت IF. بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في مخزن IF المكمل بمصل الماعز بنسبة 1٪ لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مخزن IF.

احتضان الخلايا المغسولة ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول IF المكمل بمصل الماعز بنسبة 1٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت IF ثلاث مرات لمدة عشر دقائق. لفصل الغرفة عن الشريحة الزجاجية ، ضع الشريحة أولا في حامل قاعدة الشريحة ، ثم حرك الرافع الأبيض من خلال الحامل حتى يلامس حافة الآبار.

اسحب الغرفة برفق لإزالتها من الشريحة. استخدم صندوقا أسود مغطى لحماية الشرائح من الضوء. قم بتركيب الشرائح بوسط بطيء مضاد للبهتان وقم بتغطيتها بزلات غطاء.

بعد ترك الشرائح تجف لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإغلاقها بطلاء الأظافر قبل التصوير. عزل دقاق الفأر باتباع الإجراء الموضح في بروتوكول النص. ثم ، باستخدام المقص ، افتح الأمعاء طوليا.

احتضان قسم الأنسجة الناتج في محلول KBR الغازي المثلج الذي يحتوي على إندوميتاسين ميكرومولار لمدة عشر دقائق. قم بتثبيت قسم معوي بطول سنتيمتر واحد تقريبا ، مع الجانب المخاطي لأسفل ، على صفيحة تحتوي على 0.5 سم بسمك 7٪ من الاغاروز أو المطاط الصناعي السيليكوني المعالج. باستخدام مجهر استريو تشريح مع إضاءة سفلية ، قم بتجريد الطبقات المصلية العضلية.

ثم ، قم بقطع الطبقة المصلية العضلية بشفرة مشرط من الريش. استخدم ملقطا دقيقا لرفع حافة الطبقة على طول المحور الطولي للأمعاء. أخيرا ، قم بتركيب الغشاء المخاطي بعناية على دبابيس شريط التمرير.

أمسك الأنسجة المخاطية المجردة من الحواف لتجنب التمزق. أثناء تركيب الغشاء المخاطي الحرقفي المجرد على دبابيس شريط التمرير ، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع تمزق الأنسجة في رؤوس الدبوس وتقليل تلف حواف الأنسجة. قبل معالجة الأنسجة ، قم بإعداد محلول كريبس الغازي بنسبة 95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ثم صب المحلول في غرفة Ussing. أضف 10 ميكرومولار من الجلوكوز كركيزة للطاقة إلى الحمام المصلي و 10 ميكرومولار مانيتول للحفاظ على التوازن التناضحي في الحمام المخاطي. بعد ذلك ، أدخل شريط التمرير مع الغشاء المخاطي المركب في الغرفة لتعريض كل من الجانبين القمي والقاعدي الجانبي للأنسجة لمحلول كريبس.

توازن الأنسجة اللفائفية في الحمام لمدة عشر دقائق. بعد ذلك ، قم بمعالجة الجانب القمي مسبقا ب 10 ميكرومولار فلوكستين لمدة 30 دقيقة لقياس التدفق المخاطي إلى المصلي. في النهاية ، عالج الجانب القاعدي الجانبي من الأنسجة ب 10 نانوجرام لكل مليلتر TGF beta 1 لمدة ساعة واحدة ، ثم احتضان الجانب القمي ب 20 نانومولار 5-HT لمدة 30 دقيقة.

لحساب معدلات التدفق المخاطي إلى المصلي ، اجمع 0.75 ملليلتر من الخزان المصلي ، واستبدلها بأحجام متطابقة من وسط الحمام لمنع اختلافات الضغط الهيدروستاتيكي عبر الغشاء المخاطي. لتحديد كمية 5-HT المتراكمة في الأنسجة ، قم بإزالة الغشاء المخاطي من شريط التمرير. اغسلها مرة واحدة باستخدام عازلة KRB المثلجة وضعها في أنبوب استزراع زجاجي.

احتضان الغشاء المخاطي في 0.5 مل من 10٪ KOH بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية لتحلل الأنسجة. بعد ذلك ، قم بقياس النشاط الإشعاعي في 150 ميكرولتر من المحللات بثلاث نسخ باستخدام عداد تلألؤ سائل. باستخدام طريقة برادفورد ، قم بقياس تركيز البروتين في ثلاثة إلى خمسة ميكرولتر من الأحصاد المحللة.

تظهر هنا أكياس Caco-2 المزروعة في ثقافة ثلاثية الأبعاد ملطخة بأكياس الأكتين و Caco-2 ثلاثية الأبعاد ملطخة في وقت واحد للأكتين والنوى وبروتين SERT. يظهر SERT في الغشاء اللمعي وفي المقصورات تحت القمية. لتأكيد ميزة كرات Caco-2 3D على 2D Caco-2 أحادية الطبقات ، تم إجراء تحليل اللطخة الغربية لتعبير بروتين SERT.

أظهرت النتائج التعبير المعزز لبروتين SERT في مجالات Caco-2 3D مقارنة بخلايا 2D Caco-2. أخيرا ، تم استخدام نظام غرفة Ussing لإظهار أن TGF beta يزيد من التدفق المخاطي إلى المصلي ، مما يعكس زيادة امتصاص 5-HT من الغشاء اللمعي وتراكم 5-HT المعزز الذي لوحظ في الغشاء المخاطي اللفائفي. يتم دعم هذه النتائج من خلال الحساسية الملحوظة لامتصاص 5-HT للعلاج بالفلوكستين الذي يتوافق مع تعبير SERT على الغشاء اللمعي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية تجريد الغشاء المخاطي اللفائفي وتركيبه في 15 دقيقة. أثناء اعتماد هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه عند إزالته من ، يكون للتحضير المعوي خارج نطاق التطبيق قابلية محدودة وقد يستمر لمدة تصل إلى ثلاث ساعات. يمكن استخدام أكياس Caco-2 ثلاثية الأبعاد لدراسات مختلفة مثل أحداث تهريب الأغشية أو التعبير الجيني أو تفاعل البروتين والبروتين للناقلات الظهارية.

بعد تطويرها ، تمهد تقنية 3D Caco-2 الطريق للباحثين في مجال النقل المعوي لاستكشاف حركة السوائل ودراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الدارية. لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية وإجراءات إزالة التلوث المناسبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، ستتمكن من زراعة خلايا Caco-2 في الثقافات ثلاثية الأبعاد والاستفادة من هذه الثقافات للتحقيق في تعبير الناقل الظهاري.

ستتمكن أيضا من استخدام غرفة Ussing لدراسة وظيفة نقل السيروتونين في أمعاء الفأر الأصلية.