تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حيوية الخلايا بدقة في مستنبت عصبونات الحبيبات المخيخية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علوم الأعصاب وعلم الأدوية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتنا على تمييز الخلايا الدبقية غير المرغوب فيها عن العصبونات في مستنبتات خلايا MISTA.

سيتولى استعراض الإجراءات كل من Lin Jiajia وWang Jialing وXu Dilin، وهم ثلاثة طلاب في مرحلة البكالوريوس من مختبري. ابدأ بتشريح رؤوس صغار الجرذان بعمر ثمانية أيام عن طريق إدخال المقص أولاً في الثقبة العظمى (foramen magnum) وقص جانبي الجمجمة من الأذنين وصولاً إلى العينين. بعد ذلك، استخدم الملقط لرفع الجمجمة.

استخدم الملاقط لعزل المخيخ، وضعه في طبق بقطر 35 مليمتر يحتوي على محلول التشريح. انقل الطبق إلى منصة المجهر التشريحي واستخدم زوجين من الملاقط لإزالة السحايا والأوعية الدموية. استخدم شفرة لتقطيع الأنسجة، ثم انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 30 milliliters من محلول التشريح.

قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 1, 500 x g. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي واحتفظ بالراسب. بعد ذلك، أضف محلول Trypsin إلى الراسب وأعد تعليقه عن طريق الرج بلطف.

بعد ذلك، ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، أضف محلولاً من DNase One ومثبط التربسين من فول الصويا (soybean Trypsin inhibitor) وكبريتات المغنيسيوم، ثم قم بالرج. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 1,500 x g.

بعد شفط السائل الطافي، أعد تعليق الراسب في محلول أقل تخفيفاً من DNase One، ومثبط تريبسين فول الصويا، وكبريتات المغنيسيوم. بعد ذلك، جهز أنبوبين سعة 15 ملليلتر. ضع نصف الخلايا في كل أنبوب، وقم بسحب العينات للأعلى والأسفل بالماصة من 60 إلى 70 مرة باستخدام ماصة باستير ذات سدادة قطنية لضمان تجانس الخلايا.

بعد التجانس، أضف ثلاثة مليلتر من محلول كبريتات المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم إلى كل أنبوب سعة 15 مليلتر. اترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وبمجرد انقضاء الوقت، قم بإزالة الطافي بعناية باستخدام ماصة باستور مسدودة بقطنة وانقله إلى أنابيب جديدة سعة 15 مليلتر.

قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وعند 1, 500 x g. أضف الوسط الزراعي إلى الرواسب للتخفيف حتى تصل كثافة الخلايا إلى حوالي 1.5 x 10⁶ خلية لكل ملليلتر. انقل الخلايا باستخدام الماصة إلى طبق مكون من 6 آبار، وزرعها في الحاضنة عند 37 °C و 5% CO2.

بعد مرور 24 ساعة، أضف المحلول المخزون من AraC ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1 millimolar لتثبيط نمو الخلايا الدبقية قبل إعادة الأطباق إلى الحاضنة. ثم، في اليوم السابع، أضف 50 µL من المحلول المخزون لـ D-glucose ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1 millimolar. ابدأ عملية الصبغ بخلط fluorescein diacetate بتركيز نهائي قدره 10 µg/mL، وpropidium iodide بتركيز نهائي قدره 50 µg/mL، مع 10 mL من PBS.

امزج محلول FDA/PI باستخدام جهاز الرج vortex ثم ضعه على الثلج. ضع طبق المزرعة على الثلج. اسحب الوسط الزراعي بعناية دون أن تلمس رؤوس الماصة الخلايا، ثم أضف PBS البارد ببطء.

قم بشفط محلول PBS، ثم أضف محلول العمل البارد من FDA/PI، أو FDA/PI Hoechst. ضع الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، وبعد شفط محلول العمل FDA/PI، أو FDA/PI/Hoechst، أضف محلول PBS البارد إلى كل بئر.

تأكد من إعداد المجهر الفلوري بشكل صحيح. قم بالكشف عن الانبعاثات الفلورية لـ FDA و PI و Hoechst عند 520 و 620 و 460 نانومتر على التوالي، باستخدام زمن تعريض يتراوح بين 100 و 300 مللي ثانية وكسب تماثلي قدره 2.8x. بعد جمع الصور الفلورية، التقط صورة تحت الضوء العادي باستخدام وضع تباين الطور.

لإجراء الصبغ المزدوج بـ FDA/PI، قم بتركيب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الموجبة لـ FDA فوق الطبقة الموجبة لـ PI في برنامج تحرير الرسوميات. اضبط عتامة الطبقة الموجبة لـ FDA عن طريق إدخال 50% في حقل Opacity ضمن لوحة Layers. ادمج الطبقتين عن طريق فتح قائمة Layer والنقر على زر Merge Visible.

اضبط تباين الصور المتراكبة عن طريق إدخال 50 في حقل التباين (Contrast) تحت قائمة الصورة (Image)، ثم الضبطات (Adjustments)، ثم السطوع/التباين (Brightness/Contrast). تحقق من عدم وجود خلايا موجبة لصبغتي FDA و PI معاً في الصور المتراكبة. بالنسبة للتلوين الثلاثي بـ FDA/PI/Hoechst، قم بتراكب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الموجبة لـ FDA مجدداً فوق الطبقة الموجبة لـ PI، مع ضبط شفافية الطبقة الموجبة لـ FDA ودمج الصور كما سبق.

بعد ذلك، اسحب طبقة Hoechst الموجبة فوق الطبقة المدمجة. اضبط عتامة طبقة Hoechst الموجبة عن طريق إدخال 50% في حقل العتامة (Opacity) في لوحة الطبقات، ثم ادمج الطبقتين بفتح قائمة الطبقة والنقر على زر دمج المرئيات (Merge Visible). ميز بصرياً بين الخلايا الدبقية الكبيرة وغير المنتظمة والعصبونات الحبيبية المخيخية من خلال مقارنة الصور التي تم التقاطها في وضع الفلورسنت بتلك التي تم التقاطها في وضع تباين الطور.

تُظهر الصور التالية وجود كل من العصبونات الصغيرة والخلايا الدبقية الكبيرة غير المنتظمة في مزرعة CGN. وتُظهر هذه الصورة صبغ الأحماض الأمينية GAP-43 لمزرعة CGN بعد ثمانية أيام في المختبر. وتشير السهام الزرقاء إلى العصبونات.

يظهر هنا تلوين GFAP الأميني للخلايا الدبقية. يشير السهم الأبيض إلى خلية دبقية. وتوضح هذه الصورة المأخوذة بتقنية تباين المرحلة شكل الخلايا.

يعتبر صبغ FDA/PI الذي يمكنه التمييز بين الخلايا الدبقية والعصبونات مفيداً للتقييم الدقيق لحيوية العصبونات في مستنبتات CGN. هذه صورة مدمجة لخلايا مصبوغة بثلاثة أصباغ نمت في وسط نمو طبيعي. يشير السهم إلى خلية دبقية نموذجية.

هنا، تمت معالجة مزرعة مماثلة بوسط يحتوي على نسبة منخفضة من البوتاسيوم، ويشير السهم مرة أخرى إلى خلية دبقية نموذجية. كما يُلاحظ ظهور صبغة يوديد البروبيديوم الحمراء. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح.

يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة على مزارع الخلايا المختلطة الأخرى، مثل مزارع القشرة الدماغية الأولية ومزارع الحصين الأولية، لتحليل حيوية الخلايا العصبية بدقة.