تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بدقة بقاء الخلايا العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات (فدا) والبروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخ مثقف، ثقافة العصبية الأولية المستخدمة كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث العصبية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس صلاحية الخلية بدقة في ثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب وعلم الأدوية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا التمييز بين الخلايا الدبقية غير المرغوب فيها والخلايا العصبية في مزارع خلايا MISTA.

سيظهر الإجراءات لين جياجيا ، وانغ جيالينغ ، شو ديلين ، ثلاثة طلاب جامعيين من مختبري. ابدأ في تشريح رؤوس صغار الفئران البالغة من العمر ثمانية أيام عن طريق إدخال المقص أولا في الثقبة وقطع جانبي الجمجمة من الأذنين إلى العينين. ثم استخدم الملقط لرفع الجمجمة.

استخدم الملقط لعزل المخيخ ، وضعه في طبق 35 ملم يحتوي على محلول تشريح. انقل اللوحة إلى مرحلة مجهر التشريح واستخدم زوجين من الملقط لإزالة السحايا والأوعية الدموية. استخدم شفرة لتقطيع الأنسجة ، ثم انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 30 مل من محلول التشريح.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 1،500 × جم. بعد الطرد المركزي ، استنشق المادة الطافية وحفظ الحبيبات. بعد ذلك ، أضف محلول التربسين إلى الحبيبات وأعد تعليقه عن طريق رجه برفق.

ثم ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، أضف محلول DNase One ، ومثبط فول الصويا Trypsin ، وكبريتات المغنيسيوم ، ورجها. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 1 ، 500 × جم.

بعد شفط المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في DNase One أقل تخفيفا ، ومثبط التربسين لفول الصويا ، ومحلول كبريتات المغنيسيوم. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوبين سعة 15 مل. ضع نصف الخلايا في كل أنبوب، وقم بلف الماصة لأعلى ولأسفل من 60 إلى 70 مرة باستخدام ماصة باستور مسبودة بالقطن لتجانس الخلايا.

بعد التجانس ، أضف ثلاثة ملليلتر من كبريتات المغنيسيوم ومحلول كلوريد الكالسيوم إلى كل أنبوب سعة 15 ملليلترا. اترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بمجرد انقضاء الوقت، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور مسبودة بالقطن وانقلها إلى أنابيب جديدة سعة 15 مل.

جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة و 1 ، 500 × جم. أضف وسط الثقافة إلى الحبيبات لتخفيفه إلى كثافة خلية تبلغ حوالي 1.5 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. قم بتقطيع الخلايا إلى صفيحة من 6 آبار ، وزراعتها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 24 ساعة ، أضف محلول مخزون AraC إلى تركيز نهائي يبلغ مللي مولار واحد لمنع نمو الخلايا الدبقية قبل إعادة الصفائح إلى الحاضنة. ثم ، في اليوم السابع ، أضف 50 ميكرولترا إلى محلول مخزون الجلوكوز D إلى التركيز النهائي البالغ ملليمولات واحدة. ابدأ التلوين بخلط ثنائي أسيتات الفلوريسئين إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل مليلتر ، ويوديد البروبيديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل مليلتر و 10 ملليلتر من PBS.

امزج محلول FDA / PI عن طريق الدوامة وضعه على الثلج. ضع طبق الثقافة على الجليد. قم بشفط وسط الثقافة بعناية دون لمس الخلايا بطرف الماصة ، ثم أضف PBS البارد ببطء.

قم بإسفط PBS ، ثم أضف حل عمل FDA / PI البارد ، أو FDA / PI Hoechst. ضع الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، بعد شفط حل عمل FDA / PI ، أو FDA / PI / Hoechst ، أضف PBS باردا إلى كل بئر.

تأكد من إعداد المجهر الفلوري بشكل صحيح. اكتشف انبعاثات الفلورسنت ل FDA و PI و Hoechst عند 520 و 620 و 460 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام وقت تعرض يتراوح بين 100 و 300 مللي ثانية وكسب تناظري قدره 2.8 ×. بعد جمع الصور الفلورية ، التقط صورة تحت الضوء العادي باستخدام وضع تباين الطور.

بالنسبة للتلوين المزدوج FDA / PI ، قم بتراكب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء فوق الطبقة الموجبة PI في برنامج تحرير الرسومات. اضبط عتامة الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء عن طريق إدخال 50٪ في حقل التعتيم في لوحة الطبقات. ادمج طبقتين عن طريق فتح قائمة الطبقة والنقر فوق الزر Merge Visible.

قم بتعيين تباين صور التراكب عن طريق إدخال 50 في حقل التباين ضمن الصورة ، التعديلات ، السطوع / التباين. تأكد من عدم وجود خلايا موجبة مزدوجة لإدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) وPI في صور التراكب. بالنسبة للتلوين الثلاثي FDA / PI / Hoechst ، قم بتراكب صور الخلايا عن طريق سحب الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء مرة أخرى على الطبقة الموجبة PI ، وضبط عتامة الطبقة الموجبة لإدارة الغذاء والدواء ودمج الصور كما كان من قبل.

ثم اسحب طبقة Hoechst الموجبة على الطبقة المدمجة. اضبط عتامة طبقة Hoechst الموجبة عن طريق إدخال 50٪ في حقل التعتيم في لوحة Layers ، ودمج الطبقتين عن طريق فتح قائمة Layer والنقر فوق الزر Merge Visible. قم بتمييز الخلايا الدبقية الكبيرة غير المنتظمة بصريا عن الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية من خلال مقارنة الصور الملتقطة في وضع الفلورسنت مع تلك التي تم التقاطها في وضع تباين الطور.

تظهر الصور التالية أن كلا من الخلايا العصبية الصغيرة والخلايا الدبقية الكبيرة غير المنتظمة موجودة في ثقافة CGN. تظهر هذه الصورة تلطيخ أميني GAP-43 لثقافة CGN في ثمانية أيام في المختبر. تشير الأسهم الزرقاء إلى الخلايا العصبية.

هنا ، يتم عرض تلطيخ GFAP الأميني للخلايا الدبقية. يشير السهم الأبيض إلى خلية دبقية. توضح صورة تباين الطور هذه مورفولوجيا الخلايا.

تلطيخ خطاف FDA / PI الذي يمكنه التمييز بين الخلايا الدبقية عن الخلايا العصبية مفيدا للتقييم الدقيق لصلاحية الخلايا العصبية في ثقافة CGN. هذه صورة مدمجة للخلايا ثلاثية اللون تنمو في وسط النمو الطبيعي. يظهر السهم خلية دبقية نموذجية.

هنا ، تمت معالجة ثقافة مماثلة بوسط يحتوي على بوتاسيوم منخفض ، ويشير السهم مرة أخرى إلى خلية دبقية نموذجية. لاحظ أيضا ظهور تلطيخ يوديد البروبيديوم الأحمر. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة على مزارع الخلايا المختلطة الأخرى ، مثل الثقافات القشرية الأولية ، ومزارع الحصين الأولية لتحليل بقاء الخلايا العصبية بدقة.