الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

الهدف العام لبروتوكول التصوير هذا هو وصف القياس الكمي للأس الهيدروجيني داخل الخلايا ، باستخدام مؤشر الأس الهيدروجيني المشفر وراثيا وتوضيح كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم نقل البروتون القاعدي الجانبي في نموذج البنية الكلوية للحشرات ، النبيبات المالبيجين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النقل الخلوي مثل كيف تساهم بروتينات النقل المحددة في حركة البروتون الظهاري في تنظيم الأس الهيدروجيني داخل الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم النقل الخلوي بسرعة وسهولة عبر مناطق متعددة متميزة وظيفيا من الظهارة السليمة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم الأس الهيدروجيني وظهارة الحشرات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل نيفرون الثدييات والخلايا الظهارية في الثقافة. لبدء هذا الإجراء ، ضع مجموعتين من مشابك اللحام اليدوية المساعدة على مرحلة مجهر التصوير ، مع مشبك واحد على كل جانب. بعد ذلك ، أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية المنحنية وخط التدفق ، وخط التدفق المتصل بالفراغ.

ثم قم بتركيب اليد المساعدة ومواءمتها مع مرحلة التصوير في المجهر. انشر الشحوم المفرغة على شريط السقف واضغط على مقسم البئر الغزير اللاصق على الشريط لتغطية الجزء السفلي بالشحوم. انزع مقسم البئر اللاصق وضعه على جانب الشحوم لأسفل ، فوق شريحة مطلية بالبولي ليسين.

بعد ذلك ، قم بإزالة مقسم بئر التروية لترك آبار فردية محددة في الشحوم الكارهة للماء. بعد ذلك ، ضع 200 ميكرولتر من محلول ملحي بدرجة حرارة الغرفة IPBS أو محلول ملحي عازل لفوسفات الحشرات في المدهون ودائرة جيدا على الشريحة المطلية بالبولي ليسين. بعد ذلك ، ضع الشريحة تحت المنظار ، واسكب وسط شنايدر المثلج البارد في طبق التشريح وانقل ذبابة واحدة مخدرة إليها.

امسك الذبابة من الصدر بمجموعة من الملقط واستخدم الأخرى لإمساك البطن الخلفي برفق. اسحب الطرف الخلفي للذبابة بحركات قصيرة متعمدة. بمجرد أن يصبح الحارس الخلفي مرئيا ، أمسك الطرف البعيد وحرر القناة الهضمية والقصبة الهوائية الأساسية ، عن طريق سحب الحارس الخلفي بعيدا عن الجسم من خلال القاطرات القصيرة المتكررة.

بعد ذلك ، قم بقرص الأجزاء الأمامية من الحالب باستخدام ملقط دقيق ، بمجرد أن تصبح المجموعة الثانية من antes خالية من البطن. التقط الأجزاء الأمامية الحرة باستخدام قضيب زجاج القطب ، عن طريق تحريك القضيب أسفل الحالب ، بحيث تسقط الأنابيب على كلا الجانبين. بعد ذلك ، ارفع المقبل بشكل مستقيم ، خارج المحلول ، بعد ذلك ، قم بتدوير القضيب الزجاجي بحيث يتم لصق الصمام والحالب على الجانب السفلي من القضيب.

اخفض الحالب لأسفل مباشرة على الشريحة ، ثم قم بتثبيت الحالب وأغلق الأطراف البعيدة للحالب عن طريق الضغط على الحالب على الشريحة الزجاجية. استخدم الطرف الدقيق للقضيب الزجاجي لمسح كل أنبوب برفق عبر سطح الشريحة. رعي القضيب على الشريحة لتجنب سحق النبيبات وحرك القضيب فوق الجزء العلوي من النبيب، والانتقال من بعيد إلى قريب، لإرفاق الطول الكامل لكل أنبوب على سطح الشريحة المطلية بولي ليسين.

يعتمد نجاح هذه التقنية كليا على التحديد الدقيق والتعامل الدقيق مع الأنابيب الأمامية المالبيجيانية. ستؤدي الأنابيب التالفة إلى نتائج غير متسقة. بعد ذلك ، ضع مقسم البئر الغزير اللاصق مرة أخرى على الشريحة لتشكيل سائل صغير مملوء جيدا فوق النبيبات المركبة.

بعد ذلك ، ضع العينة على مرحلة المجهر. ضع الشعيرات الدموية الداخلة والخارجة فوق فتحة مدخل ومخرج البئر الوفرة ، على التوالي. في هذا الإجراء ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء ونظام التصوير ، ثم افتح برنامج التصوير.

انظر من خلال العدسات واضبط التركيز يدويا حتى يصبح تجويف الجرأة مرئيا بوضوح تحت الضوء المنقول. ثم انقر فوق علامة تبويب الاستحواذ وحدد ، 2x2 في القائمة المنسدلة للتعتيم ، في قسم تحميل الاستحواذ. أدخل مرشح كثافة محايدة بنسبة 5٪ في مسار الضوء ، لتقليل ضوء الإضاءة وتقليل تبييض الصورة.

انقر على قناة GFP في قائمة القنوات ، ثم انقر فوق مباشر لمراقبة إشارة الفلورسنت عبر الكاميرا. بعد ذلك ، اضبط شريط تمرير الوقت لضبط وقت التعريض الضوئي ، بحيث تكون قيم البكسل الأكثر سطوعا في الرسم البياني للشدة حوالي 40٪ من القيمة القصوى. ثم انقر فوق إيقاف لإيقاف الإضاءة.

كرر الإجراءات في قناة RFP وتأكد من وجود الجزء الأولي الموسع من الأمام الأمامي وغياب مجاميع الكرز الصلبة الخلوية ، مما يشير إلى تلف الأنسجة أو الإفراط في التعبير. بعد ذلك، قم بتمكين بروتوكول تصوير اللقطات المتتابعة بالنقر فوق خانة اختيار السلاسل الزمنية. اضبط المدة في القائمة المنسدلة، في قسم السلاسل الزمنية إلى 10 دقائق، وشريط تمرير الفاصل الزمني إلى الصفر، لتعيين إجمالي وقت الالتقاط مع الحد الأقصى للحصول على الصورة.

ثم حدد مربعي GFP و RFP في قسم القناة. افتح خط IPBS لنظام الوفرة عن طريق تنشيط وحدة التحكم في الصمام المناسبة وابدأ بروتوكول التصوير بالنقر ، وابدأ التجربة. بعد دقيقة واحدة ، قم بالتبديل إلى محلول كلوريد الأمونيوم لمدة 20 ثانية ، عن طريق فتح الصمام المناسب وإغلاق خط IPBS.

بعد ذلك ، ارجع إلى IPBS عن طريق إغلاق خط كلوريد الأمونيوم وإعادة فتح صمام IPBS. لإجراء معايرة من نقطتين ، قم بإزالة مقسم البئر عن طريق تقشيره بعيدا عن الشريحة الأساسية وإزالة الشعيرات الدموية الوفيرة في المشابك من بئر التصوير. بعد ذلك ، قم بتطبيق 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت IPBS للمعايرة على الرقم الهيدروجيني 7.4.

بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول من بئر التصوير واستبدله ب 200 ميكرولتر آخر من محلول المعايرة. كرر هذه العملية أربع مرات لضمان تبادل الحلول بالكامل. بعد ذلك ، احتضن محلول التحضير والمعايرة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.

كرر بروتوكول التصوير باستخدام نفس المعلمات المحددة مسبقا ، مع تعديل دقيقة واحدة فقط من التقاط الصورة. ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت IPBS للمعايرة إلى الأس الهيدروجيني تسعة. قم بإزالة المحلول من بئر التصوير واستبدله ب 200 ميكرولتر آخر من محلول المعايرة.

بعد ذلك ، احتضان المستحضر في محلول المعايرة الثاني لمدة 10 دقائق قبل التصوير وكرر بروتوكول التصوير. بعد ذلك ، راجع الصورة الملتقطة المكدسة في برنامج تحليل الصور للتأكد من عدم تشبع وحدات البكسل في أي من القناتين ، بالنقر فوق MeanROI وأنه لم يتم الإبلاغ عن أي قيم تم الإبلاغ عنها في الرسم البياني للكثافة ، وصلت إلى الحد الأقصى للقيمة التي يمكن اكتشافها ، أثناء التمرير عبر مكدس الصور باستخدام شريط تمرير الإطار. بعد ذلك ، قم بتحليل مكدس الصور عن طريق رسم شدة الفلورسنت ونسبة التألق هي دالة للوقت ، وهنا ، نرى استجابة الفلورسنت المتوقعة لنبض كلوريد الأمونيوم في القنوات الحساسة للأس الهيدروجيني وغير الحساسة للأس الهيدروجيني للمؤشر.

تكشف نسبة هذه الإشارات عن عابر الأس الهيدروجيني داخل الخلايا. لإجراء هذا التحليل، انقر أولا فوق meanROI وحدد أداة النموذج الحر. اضغط مع الاستمرار على النقر الأيسر على الماوس ، لتتبع 50 ميكرومتر MT وانقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء رسم عائد الاستثمار.

بعد ذلك، كرر ذلك في منطقة مجاورة لآلية التحويل الرقمي، لتحديد عائد الاستثمار في الخلفية. بعد ذلك ، انقر فوق متوسط الشدة ضمن القياسات ، وقم بإنشاء جدول لقيم الشدة بالنقر فوق تصدير ، جدول بيانات ، إنشاء. انقر فوق أيقونة عجلة ساعة التكوين وقم بإلغاء تحديد جميع المعلمات، باستثناء الوقت ومتوسط الشدة.

انقر بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب الخاصة بجدول البيانات الذي تم إنشاؤه حديثا ، وحدد حفظ باسم ، وقم بتصدير البيانات كملف csv. تظهر هنا ، صورة مجال واسع ، فلورين فائق الإهليلجي في الخلايا المبدئية للخلايا الأمامية والنجمية الأمامية للمقدمة الأمامية. لاحظ أن الخلايا النجمية على شكل شريط في الجزء الأولي ، متغيرة في الجزء الانتقالي وتعرض إسقاطات خلوية مميزة في الجزء الرئيسي.

يوضح هذا الرسم البياني التغيرات المعايرة في الأس الهيدروجيني بين الخلايا استجابة لنبضة كلوريد الأمونيوم 40 ملليمولار لمدة 20 ثانية في المناطق ذات الأهمية. تشير المنحنيات المتقطعة إلى نوبات أسية مفردة مطبقة على مرحلة استرداد الحمض ، بعد سحب كلوريد الأمونيوم. والتي تشتق منها القيم الثابتة المتحللة.

يوضح هذا الرسم البياني معدل البثق الحمضي المرسوم كدالة للأس الهيدروجيني داخل الخلايا ويوضح هذا الرسم البياني التدفق الحمضي المرسوم كدالة للأس الهيدروجيني داخل الخلايا ، المشتق من النوبات الأسية من الشكل السابق. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء استخراج نبيبات malpighian في غضون 10 دقائق ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن النجاح يعتمد كليا على جودة التشريح والمعايرة الدقيقة لمؤشر الأس الهيدروجيني.

يمكن دمج هذا المستحضر مع أجهزة الاستشعار الحيوية الأخرى المشفرة وراثيا مثل مؤشرات الكالسيوم والهاليد الفلورية لدراسة حركة المذاب والإشارات داخل الخلايا في الخلايا الظهارية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ذبابة الفاكهة المالبيجيان الصحية ، وتصوير مؤشر الأس الهيدروجيني المشفر وراثيا وتحديد حركة البروتون في الخلايا الظهارية. لا تنس أن العمل مع النيترويزين يمكن أن يكون خطيرا ويتلف المستحضرات ، وبالتالي ، يجب اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، للتأكد من أنه لا يلوث أي معدات سيتم إعادة استخدامها.