جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف الإجراءات المطلوبة لنجاح توليد الفئران المعدلة وراثيا عن طريق الحقن المجهري للبويضات. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين والموظفين الفنيين المشاركين إما في مجال تكوين الفئران ، ولكن أيضا في استهداف الجينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعتمد على الحقن المباشر لبويضات الفئران ، سواء للتكامل العشوائي ، ولكن أيضا لاستهداف الجينات ، مما يسمح بتوليد الفئران المعدلة وراثيا في أقل من ستة أسابيع.

لإعداد دليل RNA واحد ، بعد تحديد التسلسلين المستهدفين المطلوبين وعمل بادئات وفقا لبروتوكول النص ، قم بتجميع قالب DNA خطي عن طريق تخفيف بلازميد PX330 إلى 10 نانوغرام لكل ميكرولتر في الماء الخالي من النوكلياز. قم بإعداد مزيج رئيسي ، مع إضافة البوليميراز في النهاية ، والاحتفاظ به على الجليد. ثم امزج المحلول وقسمه إلى ثمانية أنابيب PCR.

أضف ميكرولتر واحد من PXR330 لكل أنبوب ، وقم بتشغيل البرنامج التالي. بعد ذلك ، استخدم مجموعة تنقية PCR ومشعب ومصدر تفريغ لتنقية منتج PCR. أضف خمسة مجلدات من المخزن المؤقت الملزم إلى مجلد واحد من عينة PCR واخلطها.

ضع عمود دوران غشاء السيليكون على المشعب. لربط الحمض النووي ، قم بتطبيق جميع العينات الثمانية على العمود ، في فراغ. لغسل العينة ، أضف 0.75 مل من عازلة الغسيل إلى العمود والفراغ.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعمود عند 12 ، 000 مرة G لمدة 60 ثانية للتخلص من الإيثانول المتبقي. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مليلتر ، ثم أضف 30 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى مركز الغشاء لإزالة الحمض النووي. دع العمود يقف لمدة دقيقة واحدة وقم بالطرد المركزي ، 12 ، 000 مرة G لمدة 60 ثانية.

ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز الحمض النووي. لإجراء النسخ في المختبر باستخدام مجموعة توليف t7 RNA ، قم بإعداد المزيج الرئيسي واحتضان التفاعل في جهاز تدوير حراري عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. أضف 28 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز ولترين من الحمض النووي واحد ، واحتضن التفاعل لمدة 15 دقيقة أخرى.

لتنقية الحمض النووي الريبي ، قم بإذابة المسحوق الموجود في عمود الدوران المقدم و 650 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحقن الدقيق الخالي من النوكلياز. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء بعناية ، وقم بتغطية الأنبوب وترطيب المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 15 دقيقة. قم بإزالة الغطاء الأزرق في الأسفل وضع العمود في أنبوب ملليلتر.

ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 750 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثم ضع العمود في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وقم بتطبيق 50 ميكرولترا من محلول الحمض النووي الريبي بشكل جيد على المركز ، دون لمس جدار العمود. ثم قم بتدوير العمود عند 750 مرة G لمدة دقيقتين.

قياس تركيز الحمض النووي الريبي وتقييم جودة الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول النص. باستخدام المخزن المؤقت للحقن الدقيق الخالي من النوكلياز ، قم بتخفيف العلبة تسعة mRNA إلى 50 نانوغرام لكل ميكرولتر و sgRNAs إلى 12.5 نانوغرام لكل ميكرولتر لتجارب خروج المغلوب الجيني. أضف قالب المتبرع بتركيز 200 نانوجرام لكل ميكرولتر ، لتحرير الجينوم بناء على الإصلاح المباشر للتماثل واحتفظ به على الجليد.

استخدم قطعة الفم الشفاطية لغسل البويضات بأربع قطرات جديدة من الأحماض الأمينية الكازين. ونقلها إلى قطرة أخيرة من وسط ثمانية ، مغطاة بالزيت المعدني. لإجراء الحقن النووي الاحترافي للتكامل العشوائي ، تحت المجهر الاستريو ، استخدم قطعة فم الشفاط لتحويل ما يقرب من 50 بيضة إلى قطرة من وسط m2 ، مغطاة بزيت معدني سيتم استخدامه كغرفة حقن.

انقل غرفة الحقن إلى مجهر مقلوب وحقن البويضات المخصبة بعدد قليل من البيكوليتر من مزيج الحقن. سوف تنتفخ النواة إذا نجح الحقن. قم بإجراء الحقن السيتوبلازمي لاستهداف الجينات ، واستخدم لسان حال لنقل ما يقرب من 50 بيضة إلى قطرة من القسوم A ، تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من السيتوكالاسين B واحتضان البيض عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق.

انقل البيض إلى غرفة الحقن ، ثم ، عند ضغط منخفض جدا ، قم بحقن عدد قليل من البيكوليتر من مزيج الحقن في السيتوبلازم. استخدام ضغط التعويض للحاقن الدقيق الآلي حيثما أمكن ذلك. بعد الحقن ، استخدم لسان حال لنقل البويضات مرة أخرى إلى قطرة من الأحماض الكازوميتينية.

احتفظ بها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم تحميلها لإعادة زرعها في قناة البيض للإناث الحوامل الزائفة. بعد تخدير أنثى فأرة مسدودة وفقا لبروتوكول النص ، لإجراء إعادة الزرع في ظروف معقمة ، قم بتعريض الجهاز التناسلي باستخدام مشرط لشق طوله سنتيمتر واحد مواز للخط الأوسط الظهري. ثم ، باستخدام المقص ، قم بقص العضلات واستخدم الملقط للاستيلاء على وسادة الدهون.

اسحب المبيض برفق للخارج ، حتى تظهر قناة البيض والرحم المتصلين به بوضوح. ثم استخدم مشبك الوعاء لإصلاح وسادة الدهون. تحت المجهر الاستريو ، استخدم زوجا من المقصات الدقيقة لعمل شق في جدار قناة البيض ، على بعد بضعة ملليمترات من الأمبولة.

أيضا ، تحت المجهر الاستريو ، قم بتحميل 25 بيضة محقونة صغيرة في الشعيرات الدموية الزجاجية المتصلة بقطعة الفم. بعد ذلك ، أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في قناة البيض وطرد البيض حتى تظهر فقاعة هواء داخل الأمبولة. للتأكد من نجاح إعادة الزرع ، يجب عليك التحقق من وجود فقاعة الهواء في الأمبولا ، مما يضمن طرد جميع البويضات في المكان الصحيح ولم يبق أي منها في الشعيرات الدموية الزجاجية.

قم بإزالة الشعيرات الدموية الزجاجية برفق وأعد الجهاز التناسلي إلى البطن. ثم استخدم ثلاث خيوط جراحية صفرية غير قابلة للامتصاص لخياطة الشق ثم استخدم مشابك الجرح لإغلاق الجلد. ضع الفأر على حصيرة دافئة لتجنب انخفاض حرارة الجسم ، وحقن المسكن تحت الجلد.

راقب الماوس حتى التعافي التام. أخيرا ، قم بإجراء كتابة الجينوم وتسلسله وفقا لبروتوكول النص. يوضح هذا الشكل المواد الهلامية التحليلية التي توضح جودة تنقية الجينات المعدلة وراثيا ، وتخليق sgRNA وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد الفئران المعدلة وراثيا بنجاح.

كما هو موضح هنا ، هو قراءة نموذجية لجلسة الحقن الدقيقة للتكامل العشوائي. يجب أن يجلس التمهيدي للتنميط الجيني على الجينات المعدلة ويجب تصميمه لتوليد جزء من 200 إلى 800 زوج أساسي. في هذه القراءة لاستهداف الجينات ، تم اختيار الابادئات للتهجين مع الحمض النووي الجيني خارج المنطقة التي تم استئصالها في النهاية من قبل الرجلين.

تسمح هذه الإستراتيجية بتحديد مؤسسي الضربة القاضية المتغايرة المتغايرة والمتماثلة اللواقح. كما هو موضح هنا ، عندما يتم تحسين كل خطوة من خطوات البروتوكول ، يجب أن تصل النسبة المئوية للجرو المعدل وراثيا إلى 10٪ إلى 25٪ للتكامل العشوائي ، وهو منخفض إلى حد ما مقارنة بقدرة مكونات CRISPR على تحرير جينوم الفأر. باستخدام CRISPR لاستهداف الجينات ، يكون عدد المؤسسين أعلى بشكل عام ، حيث يتراوح من 25٪ إلى 100٪ ، فليس من غير المألوف الحصول على ذرية كاملة متماثلة الزيجوت بنجاح عند تحريرها باستخدام كريسبر.

بعد تطويرها ، تسمح هذه التقنية للباحثين في مجالات مثل علم الأعصاب أو السرطان على سبيل المثال ، باستخدام نماذج قناع جديدة لاكتشاف الآليات المرضية وترجمة ذلك في النهاية إلى استراتيجيات علاجية.