الماوس الجينوم الهندسية عن طريق Nucleases مصمم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الفئران التي تعاني من نقص الجينات بسرعة بمساعدة نوكليازات الذيل المصممة أو المخالب. يتم تحقيق ذلك من خلال تصميم وتجميع تركيبات الحمض النووي أولا التي تشفر أزواج مخالب محددة ، والتي تعمل كقوالب للنسخ في المختبر لتوليد Talon mRNAs. تتمثل الخطوات التالية من الإجراء في عزل خلايا الفئران المخصبة ، ثم حقنها ب T.والخطوة الأخيرة هي نقل الخلايا المحقونة جراحيا إلى الأمهات الحوامل الزائفات.

ذرية F الصفرية الناتجة في كثير من الأحيان عمليات حذف خاصة بالموقع للتسلسلات الجينومية التي غالبا ما تؤدي إلى فقدان وظيفة الجينات المستهدفة. على الرغم من أن الطريقة المعروضة هنا يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة الجينات في الفئران ، إلا أنه يمكن أيضا تكييف النهج الأساسي مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل الفئران والأسماك. أولا ، قم بالوصول إلى موقع مستهدف النوكليوتيدات المستجيب TAL على الموقع.

اختر برنامج TN المستهدف والصقه في تسلسل الجين المستهدف. لهذا البروتوكول. استخدم تركيبات تعبير P-C-A-G-T السبعة TALEN ومجموعة مستجيب Talen و T للبوابة الذهبية المتوفرة على الجين الإعلاني.

إذا تم استخدام تركيبات أو مجموعات تجميع أخرى لإعدادات تجميع Talen قد تكون مختلفة بالنسبة لطول الفاصل الأمثل وعدد RVs الذيل ، فاختر خيار Miller Etal 2011 ضمن إعداد استخدام بنية محددة مسبقا. ثم حدد NN ضمن علامة التبويب G substitute. يقوم البرنامج بإنشاء ملف نصي يحتوي على مواقع مستهدفة محتملة تم إنشاؤها من هذه القائمة.

حدد زوج أو أزواج Talen المطلوبة وتابع تجميع البوابة الذهبية. يعمل هذا البروتوكول مع سلالات الفئران المختبرية الأكثر استخداما ، بما في ذلك C 57 BL و six J و BDF ، وواحدة فائقة الإباضة 10 إناث متبرعات في عمر أربعة أسابيع باستخدام حقن داخل الصفاق لخمس وحدات من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل. بعد 48 ساعة ، أعط الإناث خمس وحدات من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية أيضا عن طريق الحقن داخل الصفاق مباشرة بعد حقن موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية ، والإناث واحد لواحد مع الذكور في سن التكاثر في نفس اليوم ، وإعداد الأمهات الحوامل الزائفات. الاخرين.

في صباح اليوم التالي ، ضحي بالإناث واسترجعي البويضات المخصبة عن طريق تشريح الأوكت. ثم حرر براثن البويضة في طبق زراعة الأعضاء الذي يحتوي على مليلتر من M اثنين متوسط. قم بإزالة جميع الخلايا الركامية عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول الهيالورونيداز البقري بنسبة 0.1٪ إلى طبق يحتوي على براثن السيت في M two medium.

ثم استخدم ماصة الفم لغسل الأجنة من خلال تغييرين أو ثلاثة تغييرات في وسط M two لإزالة الهيالورونيداز. استمر في علاج الهيالورونيداز للأجنة التي لم تنفصل بعد عن الخلايا الركامية. يمكن تخزين الأجنة المعزولة في M 16 ، متوسطة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم حقنها بشكل دقيق.

تحضير 100 ميكرولتر من محلول الحقن الذي يحتوي على 10 نانوجرام لكل ميكرولتر من كل ذيل. Nuclease و mRNA و زوج وجهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 30 ، 000 جم إلى الحبيبات. أي جزيئات قد تسد إبر الحقن.

ثم احتفظي بالمزيج على الثلج. خطط لحقن البويضات في مرحلتها المؤيدة للنواة في وقت مبكر من بعد الظهر. اغمر ما يقرب من 100 جنين في M اثنين من الوسط تحت طبقة من الزيت المعدني واعمل على مجهر مقلوب بدون بصريات DIC مرعبية.

أقل من 20 × تكبير ، حدد الخلايا ذات النوى المميزة. يمكن فرز البويضات باستخدام حقن فارغ ، حمولة شعرية ، الشعيرات الدموية للحقن ، قبل استخدامها مباشرة مع واحد إلى اثنين من ميكرولتر من محلول الحقن. ثم قم بتثبيته برأس الحقن المجهري.

ثم استنشق خلية مختارة مع شعيرات دموية قابضة وقم بحقن ضحل من الرنا المرسال النووي الريبي في السيتوبلازم. تجنب ملامسة النوى. يجب أن يظل حجم الحقن منخفضا.

عند أول علامة على الانتفاخ السيتوبلازمي ، اسحب الإبرة. عادة ، يجب أن يعيش حوالي 80 إلى 90٪ من الأجنة دون فورية. لزيادة كمية mRNA المحقون ، اجعل المحلول أكثر تركيزا بعد الحقن المجهري للخلايا المتاحة.

انقلها إلى وسائط M 16 باستخدام ماصة الفم. احتضان الأجنة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم انقل أولئك الذين يبقون على قيد الحياة إلى أمهات حاضنات زائفات.

في اليوم السابق للحقن المجهري ، تحفز الحمل الزائف في فئران واحدة من القرصين البالغين من العمر ثلاثة إلى ستة أشهر عن طريق تزاوجها مع الذكور المقطاعين VAs. في صباح اليوم التالي ، اختر الإناث اللواتي لديهن سدادة إلزامية واضحة لاستخدامها كمتلقين للجنين. ستعود الإناث غير المستخدمة من حالتهن الحاملية الزائفة في غضون ثلاثة أسابيع ويمكن إعادة استخدامها بعد ذلك.

ضع أنثى أم حاضنة مخدرة على سطح دافئ على بطنها. ثم تطهير منطقة الشق عن طريق رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. مشط الشعر المبلل بعيدا عن موقع الشق المخطط له.

الآن افتح التجويف البريتوني بالمقص وقم بإخراج قرن الرحم. للقيام بذلك. اسحب الوسادة الدهنية المتصلة بالمبيض وشل حركة الأعضاء التناسلية بمشبك البلدغ.

تأكد أيضا من الحفاظ على رطوبة الأعضاء بمحلول كلوريد الصوديوم الدافئ بنسبة 0.9٪. في هذه المرحلة ، قم بفرز 12 إلى 20 جنينا قابلا للحياة وقم بتحميلها في شكل شعري زجاجي رقيق. باستخدام ماصة الفم ، قم أولا بشفط فقاعة هواء صغيرة ، ثم استنشق الأجنة باستخدام ملقط دقيق.

أمسك UCT برفق في أعلى مضخم الصوت وقم بإنشاء ثقب صغير في جدار UCT باستخدام إبرة قياس 30. أدخل الشعيرات الدموية المحملة في الحفرة وقم بتفجير الأجنة برفق في الأمبير حتى ترى أن فقاعة الهواء قد تم إزاحتها من الشعيرات الدموية. ثم قم بإزالة الشعيرات الدموية.

استبدل الأعضاء التناسلية على الفور مرة أخرى في تجويف الجسم وأغلق التجويف البريتوني بخياطة واحدة. بعد ذلك ، أغلق الجلد باستخدام مقطع أو اثنين من مقاطع الجرح تسعة ملليمترات. أعد إلى قفص منزله وراقب عليه حتى يزول التخدير.

ثم قم بإيواء الإناث في مجموعات اجتماعية مستقرة من فئران إلى ثلاثة فئران لتقليل التوتر في الأيام الثلاثة الأولى بعد الجراحة ، تأكد من توفير مسكن مثل DEF Falcon في مياه الشرب لكل جراد في جينوم الفأر الذي يستهدف نوكليازات المصممة. تم تصميم الاختبار القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد المؤسسة التي تحمل أليل متحور مرغوب. في المثال الأول ، نشأ المؤسسون من الحقن المجهري لزوج نوكلياز الذيل.

تحليل استهداف منطقة الطلاء لجين بروتين البريون للفأر بواسطة هضم نوكلياز T سبعة لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يعتمد اختبار هضم T السبعة Endonuclease على تكوين الازدواج غير المتجانس بين خيوط الحمض النووي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة عن الأليلات المتحولة والبرية. تم الكشف عن الطفرات المستحثة عن تالون داخل المنطقة الجينومية المستهدفة للمؤسسين الفرديين من خلال ظهور 250 و 110 من منتجات الهضم الطويل المزدوجة بالإضافة إلى منتج PCR كامل الطول.

بدلا من ذلك ، يمكن أن تخضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لملخص تقييد إذا كان موقع تقييد التشخيص المناسب موجودا داخل منطقة المباعد لزوج نوكلياز المصمم. في المثال الثاني ، يستهدف ZFN موقع تقييد XPO واحد موجود داخل المقدمة ، أحد موضع الماوس Rosa 26. هنا تشير العصابات غير المهضومة إلى وجود طفرات.

علامة العلامات النجمية ، عدم وجود أي منتجات مهضومة تشير بقوة إلى أن مؤسسا يحمل طفرات في كلا الأليلين من الجين المستهدف. يكشف استنساخ وتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المهضومة أن الفئران المؤسسة يمكن أن تؤوي تعديلين أو أكثر من التعديلات المميزة للأليل المستهدف. يشير عدم وجود تسلسلات من النوع البري إلى الاستئصال الكامل للجين المستهدف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتصميم نوكلياز الذيل ، وتجميع الذيل ، وتركيبات النوكلياز ، وكيفية استخدامها لتوليد الفئران الطافرة عن طريق الحقن المجهري المباشر للأوزيد. يمكن تكييف هذه الطريقة للعمل مع فئات أخرى من نوكليازات المصممين ، مثل الزنك أو نوى الإصبع أو CAS nine crispr. يمكن أن يسهل أيضا تعديل الجينوم عن طريق إعادة التركيب المتماثل من خلال الحقن المتزامن للنوكلياز وقالب استهداف الجينات المناسب.