مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الفحص باستخدام المغناطيسية-فلوري نانوسينسور: الكشف السريع عن O157:H7 كولاي

والهدف العام من هذا البروتوكول توليف nanosensors الفنية المحمولة، فعالة من حيث التكلفة، والموجهة خصيصا للكشف السريع عن البكتيريا المسببة للأمراض من خلال مزيج من الاسترخاء المغناطيسي وطرائق الانبعاثات الأسفار.

الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تصميم وتوليف أجهزة استشعار نانوية ثنائية النمط قادرة على اكتشاف الملوثات البكتيرية مثل الإشريكية القولونية O157: H7. يتم تصنيع المستشعرات النانوية المغناطيسية الفلورية عن طريق إضفاء الطابع الوظيفي على جزيئات أكسيد الحديد النانوية عبر إجراء من خطوتين. أولا ، يتم اقتران الأجسام المضادة المستهدفة على سطح الجسيم النانوي.

ثم يتم تحميل صبغة الفلورسنت في الترميز الخاص بها. يسمح تقشير هذه الطرائق بالكشف السريع والحساس عن الملوثات البكتيرية في كل من المحاليل منخفضة وعالية التركيز. في حالة وجود كمية صغيرة من البكتيريا ، سوف تتجمع المستشعرات النانوية حول البكتيريا بسبب استهداف الأجسام المضادة المترافقة.

يغير هذا الاحتشاد تفاعلات النواة المغناطيسية للمستشعرات النانوية مع بروتونات الماء المحيطة ، مما يسمح بالكشف الحساس عن التغيرات في قيم الاسترخاء المغناطيسي. مع زيادة تركيز الملوثات البكتيرية في المحاليل ، ينخفض الاحتشاد وتقل قدرة الطريقة المغناطيسية على تحديد كمية التلوث. ومع ذلك ، مع زيادة تركيز البكتيريا ، يزداد أيضا التقديم الفلوري لأجهزة الاستشعار النانوية الحيوية.

ولهذا السبب يعد الاقتران بين الطرائق المغناطيسية والفلورية أمرا مهما. سمح هذا المزيج بالكشف عن أقل من وحدة تشكيل مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية O157: H7 في غضون دقائق. تتمثل الخطوة الأولى في نظام أجهزة الاستشعار النانوية المغناطيسية الفلورية في تحضير محلول ملح الحديد الذي يتكون من كلوريد الحديد والحديديك.

ستوفر المكواة لأجهزة الاستشعار النانوية نواة مغناطيسية تسمح بقدرتها على التكيف مع منصات الاسترخاء المغناطيسية. الحلول الإضافية اللازمة هي حمض البولي أكريليك وهيدروكسيد الأمونيوم. يتم إدخال حمض الهيدروكلوريك إلى محلول ملح الحديد ، والذي يضاف بعد ذلك إلى محلول هيدروكسيد الأمونيوم أثناء الدوامة.

أخيرا يضاف محلول حمض البولي أكريليك ، ويتم تدوير الخليط الناتج لمدة ساعة إضافية بينما يستمر التفاعل. يتم طرد المحلول الناتج من أجل ترسيب الجزيئات الأكبر وعزل الجسيمات النانوية التي يقل حجمها عن 100 نانومتر. ثم يتم غسيل المحلول بالكلى طوال الليل للتنقية.

الخطوة التالية هي اقتران استهداف الأجسام المضادة لترميز حمض البولي أكريليك للجزيئات النانوية لحمض الحديد المركبة حديثا. تشمل المواد المطلوبة المخزن المؤقت MES و EDC و NHS والأجسام المضادة المختارة. يضاف EDC أولا إلى محلول الجسيمات النانوية ، يليه NHS وأخيرا الجسم المضاد.

ثم يوضع الخليط على خلاط منضدية لمدة ثلاث ساعات بينما يستمر التفاعل. يتم تنقية المحلول باستخدام عمود مغناطيسي. يلتقط العمود الممغنط الجسيمات النانوية ، مما يسمح فقط للأجسام المضادة العائمة الحرة بالخروج.

بعد ذلك يتم غسل العمود باستخدام المخزن المؤقت PBS ، ويتم جمع المستشعرات النانوية المترافقة. ثم تكون الجسيمات النانوية جاهزة لإضافة صبغة الفلورسنت ، مما يوفر الطريقة الرئيسية الثانية المستخدمة للكشف. تتمثل إحدى أهم ميزات المستشعر النانوي لدينا في الجمع بين الأساليب المغناطيسية والفلورية ، وهو أمر مهم لعدد من الأسباب.

أولا ، يسمح الجمع بين الطرائق لكل واحد بالتحقق من الآخر ، مما يقلل بشكل كبير من مخاطر الإيجابيات الكاذبة والسلبيات الكاذبة ، والتي تعد واحدة من أكبر العقبات التي تواجهها منصات التشخيص المختلفة المستخدمة اليوم. وثانيا ، فإن الجمع بين الطرائق يوسع بشكل كبير النطاق الذي لا يمكننا من خلاله اكتشاف التلوث البكتيري فحسب ، بل يمكننا أيضا تحديده. الخطوة الأخيرة في تحضير أجهزة الاستشعار النانوية هي تغليف صبغة الفلورسنت في ترميز الجسيمات النانوية.

يتم تحقيق ذلك ببساطة عن طريق إضافة صبغة إلى المحلول أثناء الدوامة ، ثم إتاحة مزيد من الوقت للصبغة لتنتشر في ترميز المستشعر النانوي. ثم يتم تحليل أجهزة الاستشعار النانوية التي تعمل بكامل طاقتها مرة أخيرة للتنقية. من أجل توصيف أجهزة الاستشعار النانوية ، يتم تسجيل الحجم والإرسال الفلوري باستخدام المنزيزر وقارئ الألواح الفلورية.

تضاف عينة صغيرة من المستشعر النانوي إلى محلول ماء كوفيت وتوضع في المنزيزر لتسجيل الحجم. لتحليل التألق ، يتم وضع عينة من المستشعر النانوي على لوحة 96 بئر وإدخالها في قارئ اللوحة الفلورية. من الناحية المثالية ، سيكون قطر المستشعرات النانوية حوالي 70 نانومتر ، ويبلغ حجمها الفلوري 575 نانومتر.

بالإضافة إلى تخليق أجهزة الاستشعار النانوية ، فإن زراعة البكتيريا ضرورية لتوفير الأهداف البكتيرية في المختبر. يستخدم مخزون البكتيريا من الجلسرين لتحضير ثقافة في مرق المغذيات. ثم يسمح لهذا الحل بالحضانة.

بعد فترة الحضانة الأولية ، يتم إجراء التخفيفات التسلسلية من أجل تحقيق مجموعة واسعة من التركيزات البكتيرية. يتم طلاء مائة ميكرولتر من كل تركيز على صفيحة مثقاب مغذية ثم يتم احتضانها لمدة 24 ساعة. بعد هذه الحضانة ، يتم حساب المستعمرات الموجودة على كل لوحة من أجل تحديد وحدة تشكيل المستعمرة ، أو عدد CFU لكل مل من كل مخزون مخفف.

الآن بعد أن تم تحضير محاليل المخزون البكتيري ، يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع أجهزة الاستشعار النانوية المعدة. وأحد الجوانب المهمة لهذا النمط المصلي المعين للبكتيريا الذي يميزها عن الأنماط المصلية الأخرى هو لنفترض أنك إذا أصبت بالأنماط المصلية الأخرى ، فأنت بحاجة إلى العديد من وحدات تكوين المستعمرات للإصابة بالعدوى. ولكن في هذا الإشريكية القولونية بالذات ، تكون وحدات تشكيل المستعمرات من 10 إلى 100 وحدة تشكيل مستعمرة جيدة بما يكفي لإصابتك بالعدوى.

تم إنشاء تقنيتنا بطريقة لا تفوتك حتى تلوث بكتيري مستعمرة واحدة. من أجل إعداد حلول للقراءة في مقياس الاسترخاء المغناطيسي ، يتم سحب 300 ميكرولتر من PBS أولا في أنبوب Eppendorf. ثم تضاف عينة من المخزون البكتيري ، تليها إضافة أجهزة الاستشعار النانوية.

ثم يتم نقل المحلول إلى أنبوب زجاجي ، ويتم وضع قطعة من البارافيلم في الأعلى لمنع التبخر. ثم يتم وضع الأنبوب الزجاجي داخل أنبوب أكبر بالرنين المغناطيسي النووي ويتم إدخاله في مقياس الاسترخاء المغناطيسي. يتم استخدام محلول أساسي لا يحتوي على بكتيريا وجهاز استشعار نانوي فقط و PBS للحصول على قراءة T2 الأساسية كما هو موضح.

ثم يتم إدخال المحاليل التي تحتوي على تركيزات مختلفة من البكتيريا في مقياس الاسترخاء المغناطيسي للتحليل ، وتحدث التغييرات في قيم T2 بسبب الارتباط بين أجهزة الاستشعار النانوية والبكتيريا. كما هو موضح, يمكن الكشف عن وجود عدد قليل من CFU البكتيرية في غضون دقائق باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، مع زيادة تركيز البكتيريا ، تكون قراءة التصوير بالرنين المغناطيسي أقل قابلية للقياس الكمي ، وهذا هو السبب في أن استخدام بيانات الإرسال الفلوري يرقى أيضا إلى القياس الكمي الدقيق للبكتيريا.

قبل جمع بيانات التألق ، يجب أولا الطرد المركزي للعينة. يتم نقل المحلول من الأنبوب الزجاجي إلى أنبوب Eppendorf ثم يتم طرده بالطرد المركزي. هذا يفصل البكتيريا وأجهزة الاستشعار النانوية المرتبطة بها عن أجهزة الاستشعار النانوية العائمة الحرة في المحلول.

يتم التخلص من المادة الطافية ، ويتم تعليق الحبيبات البكتيرية في PBS. أخيرا ، يمكن تحليل العينة عن طريق تقديم الفلورسنت. ستكون قوة الانبعاث نسبة إلى كمية أجهزة الاستشعار النانوية المتبقية في المحلول ، وبالتالي أيضا كمية البكتيريا الموجودة.

كما يتضح ، فإن الخضوع الفلوري يقوي مع زيادة تركيز البكتيريا ، ويصبح أكثر حساسية أيضا. هذا هو السبب في أن الاقتران بين كل من الطرائق المغناطيسية والفلورية يسمح باكتشاف التلوث البكتيري وقياسه في مراحل النمو المبكرة والمتأخرة. بالإضافة إلى الكشف عن البكتيريا في المحاليل البسيطة مثل PBS ، تمتلك أجهزة الاستشعار النانوية هذه أيضا القدرة على العمل في وسائط أكثر تعقيدا ، مثل مياه البحيرة أو الحليب.

علاوة على ذلك ، تم اختبار هذه المستشعرات النانوية للتأكد من خصوصيتها في وجود البكتيريا غير المستهدفة والبكتيريا المستهدفة المعطلة بالحرارة. كما هو موضح ، فإن أجهزة الاستشعار النانوية المغناطيسية الفلورية لها تفاعل ضئيل أو معدوم مع البكتيريا غير المستهدفة أو غير الحية بسبب خصوصية الأجسام المضادة المترافقة. هذا يدل على فعاليتها في الكشف عن بكتيريا معينة أثناء وجود أنواع أخرى.

أخيرا ، من المهم أيضا ملاحظة أنه يمكن تخصيص هذه المستشعرات النانوية بسهولة للكشف عن مسببات الأمراض الأخرى أيضا. يمكنك التصنيع أو يمكنك صياغة هذه المستشعرات النانوية التي قمنا بها في مختبرنا في غضون شهر واحد الآن. يمكنك القيام بذلك في غضون شهر واحد ، ويمكن أن يمنحك هذا الشهر من المنتج 10 سنوات من التطبيق.