التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في

الهدف العام من هذه التجربة هو تحليل أنماط إسقاط العصبونات الحركية في أجنة Drosophila melanogaster في مراحلها المتأخرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التطور العصبي، مثل توجيه المحاور الحركية وتكوين الدوائر العصبية الفرعية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر تصوراً دقيقاً للمحاور الحركية في الأجنة النامية، مما يسمح بإجراء تحليل موثوق لمسارات المحاور واستهداف العيوب في تلك الظروف.

بعد يوم واحد من إعداد أطباق جمع البيض، استبدل الأطباق بأخرى جديدة تحتوي على مسحة من عجينة الخميرة المُحضرة حديثاً. وبعد مرور ثلاث ساعات على الأطباق الجديدة، انقل الذباب إلى زجاجات غذاء جديدة، ثم قم بحضن أطباق البيض طوال الليل عند درجة حرارة 25 °C.

في الصباح، أضف 1.8 milliliters من محلول PBT إلى الأطباق. واستخدم مسحة قطنية لتحريك الأجنة من مكانها. ثم، وبواسطة ماصة سعة 1 milliliter، انقل الأجنة والمحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

بمجرد استقرار الأجنة في القاع، قم بسحب أكبر قدر ممكن من المحلول. ثم اشطف الأجنة مرتين باستخدام 1 mL من PBT في كل شطفة. لإزالة الغشاء الكوريوني من الأجنة، استبدل الشطفة الأخيرة بـ 1 mL من المبيض (bleach) بتركيز 50% وقم بهز الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإزالة المبيض، اشطف الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBT. بعد ذلك، استبدل شطفة الغسل الأخيرة بنصف ميليلتر من heptane بتركيز 100% ونصف ميليلتر من paraformaldehyde بتركيز 4%. الآن، قم بحضن الأجنة لمدة 15 دقيقة مع الرج اللطيف.

بعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة طبقة المحلول السفلية وأضف 500 µL من الميثانول بتركيز 100%. الآن، قم برج الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية لإزالة مح المكونات الصفارية (devitellinize) من الأجنة. بعد ذلك، قم بإزالة المحلول العلوي، وأضف 500 µL من الميثانول بتركيز 100% وارج الأنبوب لمدة 10 ثوانٍ أخرى.

بعد رج الأنبوب، قم بالنقر عليه للمساعدة في ترسيب الأجنة وإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول. بعد ذلك، اشطف الأجنة لفترة وجيزة باستخدام 100% methanol. ثم قم فوراً بشطف الأجنة باستخدام PBT ثلاث مرات.

الآن، أعد تعليق الأجنة في 1 mL من محلول PBT الطازج. ثم حضن الأجنة عند 37 °C لمدة 15 دقيقة لتحضيرها لصبغة LacZ. وأثناء فترة تحضين الأجنة، قم بتحضير حصة قدرها 1 mL من محلول صبغة X-gal.

قم بتدفئة الجزء المقتطع في حمام مائي عند درجة حرارة 65 درجة مئوية حتى يصبح عكراً. ثم انقله إلى كتلة تسخين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وبعد تدفئة الأجنّة لمدة 15 دقيقة، قم بإزالة محلول PBT، واستبدله بالجزء المقتطع من محلول الصبغ بحجم 1 ملل.

ثم أضف 20 µL من ركيزة X-gal. قم بحضن الأنبوب عند 37 °C مع الرج اللطيف لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات تقريبًا حتى يتكون راسب أزرق. بعد ذلك، قم بإزالة محلول الصبغ واغسل الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBT في درجة حرارة الغرفة.

بعد عمليات الشطف، استخدم مسباراً إبرياً أو ملاقط لفرز الأجنة يدوياً تحت مجهر تشريحي. اجمع الأجنة المصبوغة المطلوبة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة نصف مليمتر باستخدام ماصة سعة واحد مليمتر. بعد ذلك، اغسل الأجنة المختارة بـ 0.4 milliliters من PBT.

بعد ذلك، استبدل PBT بـ 0.3 ملليلتر من محلول الحجب واترك الأجنة لتحضن مع التقليب اللطيف لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، أضف 75 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية وواصل التحضين طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، اغسل الأجنة باستخدام PBT لمدة ساعتين تقريباً، مع تغيير محلول الغسيل كل 30 دقيقة تقريباً.

بعد الغسيل، أضف 0.3 milliliters من محلول الحجب الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي، ثم قم بتحضين الأنبوب مع رج خفيف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. وفي الصباح التالي، اغسل الأجنة باستخدام PBT لمدة ثلاث ساعات تقريباً، مع تغيير محلول PBT خمس مرات على الأقل خلال فترة الغسيل.

بعد الغسيل، أعد تعليق الأجنة في 0.3 milliliters من محلول dab وأضف 2 microliters من hydrogen peroxide بتركيز 3%. ثم، قم بحضنها في الظلام مع هز خفيف في درجة حرارة الغرفة حتى يتكون راسب كافٍ. يستغرق ذلك عمومًا من 30 إلى 60 دقيقة.

بعد ذلك، اشطف الأجنة بمحلول PBT أربع مرات وأعد تعليقها في 0.2 milliliters من محلول التثبيت. الآن، اترك الأجنة لتصل إلى حالة التوازن في الظلام عند درجة حرارة 4 degrees Celsius. ولإجراء عملية التشريح الطولي للأجنة، ضعها على شريحة زجاجية.

أولاً، انقلهم إلى قطرة من الجلسرول بحيث يكون الجانب البطني للأعلى. بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي، اقطع الجزء الأمامي وما يعادل 1/4 طول الجسم، وأزل المنطقة الخلفية القصوى التي تخلو من المحاور الحركية. الآن، وباستخدام مسبار إبري، انقل التحضير خارج الجلسرول بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى، وضعه أفقياً في مجال الرؤية.

تتطلب الخطوة التالية إبرة تنجستن دقيقة يتم إدخالها في المنطقة المجوفة لمسبار الإبرة، ثم ثني طرفها. وباستخدام إبرة التنجستن، قم بإجراء قطع صغير عند الطرف الخلفي للجنين وواصل القطع على طول الخط الناصف الظهري. تأكد من أن طرف إبرة التنجستن لا يلامس سطح الشريحة الزجاجية أثناء التشريح، لأن الإبرة ستنثني بسهولة عند ملامستها للزجاج.

بعد ذلك، باستخدام المسبار، أعِد التحضير إلى قطرة الجلسرين وضعها بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. هناك، افصل الأمعاء عن جدار الجسم عن طريق بسط كل جدار للجسم في اتجاه بطني-جانبي. يجب أن ينفصل جدارا الجسم عن بعضهما البعض.

استخدم المسبار الآن لنقل سدائل جدار الجسم بعناية إلى شريحة زجاجية. وعلى الشريحة، استخدم إبرة تنجستن لإزالة الأعضاء الداخلية عن طريق دفعها جانبياً. ولتثبيت إبرة التنجستن وحمايتها من التلف، حافظ على وضع المسبار داخل الإبرة المجوفة وأبقِ إبرة التنجستن مسنودة على سطح الشريحة الزجاجية أثناء تحريكها.

الآن، قم بتثبيت التحضيرات في 8 µL من محلول التثبيت على شريحة زجاجية جديدة. ثم ضع غطاء الشريحة وأغلق الحواف باستخدام طلاء أظافر عادي. بعد ذلك، التقط الصور بدقة عالية باستخدام بصريات DIC.

باستخدام الطريقة الموصوفة، تم صبغ أجنة في المرحلة 16 باستخدام جسيم مضاد Fas2 وتحضيرها لتصور العصبونات الحركية والأنصاف القطعية البطنية A3 و A4. عادةً، تمتد سبعة عصبونات حركية على الأقل وتتجمع محاورها لتشكل فرع العصب ISNb. كما أمكن تحديد العديد من الحزم العصبية المحيطة في هذا التحضير. عندما تصل الحزمة العصبية بين القطعية إلى نقطة الاختيار عند العضلتين 6 و 7، ينفصل محورين عصبيين بشكل انتقائي ويغذيان العضلتين 6 و 7.

ويحدث الشيء نفسه عند نقاط اختيار أخرى مع امتداد الحزمة ظهرياً. ثم، عند نقطة الاختيار الأخيرة، يقوم محوران عصبيان بتعصيب العضلة 12. وفي المقابل، تفشل المحاور العصبية ذاتها في الأجنة الطافرة لـ Sema-1a في فك الارتباط عند نقاط اختيارها.

ليس هذا الأمر مفاجئاً، حيث يُعرف منتج Sema-1 aegean بدوره في المساعدة على تكوين الروابط بين المحاور الحركية والعضلات المستهدفة أثناء التطور العصبي. وبالتالي، يمكن استخدام الطريقة الموصوفة لتحليل الأنماط الظاهرية الطافرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فرز الأجنة الطافرة المطلوبة، وكيفية صبغ أنماط الإسقاط المحوري للعصبونات الحركية مناعياً، وكيفية تشريح الأجنة المثبتة لإعداد العينات المسطحة.