التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في ذبابة الفاكهة

الهدف العام من هذه التجربة هو تحليل أنماط إسقاط الخلايا العصبية الحركية في أجنة المرحلة المتأخرة من ذبابة الفاكهة السوداء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التطور العصبي ، مثل توجيه المحور العصبي وتكوين القطع العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تصورا دقيقا للمحور العصبي الحركي في الأجنة النامية ، مما يسمح بتحليل موثوق به لاكتشاف المسار المحوري واستهداف عيب الحالة.

بعد يوم واحد من إعداد أطباق جمع البيض ، استبدل الأطباق بأخرى جديدة تحتوي على القليل من معجون الخميرة الطازج. بعد ثلاث ساعات على الأطباق الطازجة ، انقل الذباب إلى زجاجات طعام جديدة. واحتضان أطباق البيض طوال الليل عند 25 درجة مئوية.

في الصباح ، أضف 1.8 مل من محلول PBT إلى الأطباق. واستخدم قطعة قطن لإخراج الأجنة. ثم ، باستخدام ماصة سعة 1 مليلتر ، انقل الأجنة والمحلول إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

بمجرد أن تستقر الأجنة في القاع ، استنشق أكبر قدر ممكن من المحلول. ثم اشطف الأجنة مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBT لكل شطف. لإزالة الأجنة ، استبدل الشطف الأخير بمليلتر واحد من المبيض بنسبة 50٪ وهز الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإزالة المبيض ، اشطف الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBT. بعد ذلك ، استبدل الشطف الأخير بنصف مليلتر من 100٪ هيبتان ونصف مليلتر من 4٪ بارافورمالدهايد. الآن ، احتضان الأجنة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف.

بعد الحضانة ، قم بإزالة طبقة المحلول الأساسية وأضف 500 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪. الآن ، لمدة 30 ثانية ، هز الأنبوب بقوة لإزالة الأجنة. بعد ذلك ، قم بإزالة المحلول المغطى ، وأضف 500 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ وقم بهز الأنبوب لمدة 10 ثوان أخرى.

بعد هز الأنبوب ، اضغط عليه لمساعدة الأجنة على الاستقرار وإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول. بعد ذلك ، اشطف الأجنة لفترة وجيزة بالميثانول بنسبة 100٪. ثم اشطف الأجنة على الفور باستخدام PBT ثلاث مرات.

الآن ، أعد تعليق الأجنة في مليلتر واحد من PBT الطازج. واحتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتحضيرها لتلوين LacZ. أثناء احتضان الأجنة ، قم بإعداد كمية ملليلتر واحدة من محلول تلطيخ X-gal.

قم بتسخين الكمية في حمام مائي بدرجة حرارة 65 درجة مئوية حتى يصبح غائما. ثم انقله إلى كتلة حرارية 37 درجة مئوية. بعد تسخين الأجنة لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول PBT ، واستبدله بكمية واحدة من محلول التلوين.

ثم أضف 20 ميكرولترا من ركيزة X-gal. لمدة ساعتين إلى أربع ساعات تقريبا ، احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف حتى يتشكل راسب أزرق. ثم قم بإزالة محلول التلوين وشطف الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBT بدرجة حرارة الغرفة.

بعد الشطف، استخدم مسبارا بإبرة أو ملقطا لفرز الأجنة يدويا تحت مجهر التشريح. اجمع الأجنة الملطخة ذات الأهمية في أنبوب طرد مركزي دقيق نصف ملليمتر باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. بعد ذلك ، اغسل الأجنة المختارة ب 0.4 مل من PBT.

بعد ذلك ، استبدل PBT ب 0.3 مل من محلول المنع واترك الأجنة تحتضن مع تحريض لطيف لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، أضف 75 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي واستمر في الحضانة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأجنة باستخدام PBT لمدة ساعتين تقريبا ، مع تغيير محلول الغسيل كل 30 دقيقة تقريبا.

بعد الغسيل ، أضف 0.3 مل من محلول الانسداد الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي واحتضان الأنبوب بهزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأجنة باستخدام PBT لمدة ثلاث ساعات تقريبا. قم بتغيير PBT خمس مرات على الأقل خلال فترة الغسيل.

بعد الغسيل ، أعد تعليق الأجنة في 0.3 مل من محلول ربت وأضف ميكرولترين من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين. ثم احتضنها في الظلام مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة حتى يتم إنتاج كمية كافية من الرواسب. يستغرق هذا بشكل عام من 30 إلى 60 دقيقة.

ثم اشطف الأجنة باستخدام PBT أربع مرات وأعد تعليقها في 0.2 مل من محلول التركيب. الآن ، اسمح للأجنة بالتوازن في الظلام عند 4 درجات مئوية. لتقطيع الأجنة ، قم بتنظيمها على شريحة زجاجية.

انقلهم أولا إلى قطرة من الجلسرين الجانب البطني لأعلى. بعد ذلك ، تحت مجهر التشريح ، قم بقطع الجزء الأمامي و 1/4 من طول الجسم وإزالة المنطقة الخلفية الخالية من المحاور الحركية. الآن ، باستخدام مسبار إبرة ، انقل المستحضر من الجلسرين ، والجانب الظهري الموجه لأعلى ووضعه أفقيا في مجال الرؤية.

الخطوة التالية إبرة تنجستن دقيقة تم إدخالها في المنطقة المجوفة لمسبار الإبرة ، ثم ثنيها في النهاية. باستخدام إبرة التنغستن ، قم بعمل قطع صغير في الطرف الخلفي للجنين واستمر في قطع خط الوسط الظهري. تأكد من أن طرف إبرة التنغستن لا يلمس سطح الشريحة الزجاجية أثناء التشريح ، لأن الإبرة ستنحني بسهولة على الزجاج.

ثم ، مع عودة المسبار إلى قطرة الجلسرين وضعها على الجانب الظهري لأعلى. هناك ، افصل القناة الهضمية عن جدار الجسم عن طريق فتح كل جدار من جدران الجسم في اتجاه بطني جانبي. يجب أن ينفصل جداران الجسم.

الآن باستخدام المسبار ، حرك لوحات جدار الجسم بعناية على شريحة زجاجية. على الشريحة ، استخدم إبرة التنغستن لإزالة الأعضاء الداخلية عن طريق دفعها بشكل جانبي. لتثبيت إبرة التنغستن ومنعها من التلف ، حافظ على إبرة التنغستن مجوفة وقم بإمساك إبرة التنغستن مثبتة على سطح الشريحة الزجاجية أثناء التلاعب بإبرة التنغستن.

الآن ، قم بتركيب المستحضرات في ثمانية ميكرولترات من محلول التركيب على شريحة زجاجية جديدة. قم بإرفاق زلة غطاء وأغلق الحواف لأسفل باستخدام طلاء الأظافر العادي. بعد ذلك ، التقط صورا بدقة عالية باستخدام بصريات DIC.

باستخدام الطريقة الموصوفة ، تم تلطيخ أجنة المرحلة 16 بالجسم المضاد Fas2 وإعدادها لتصور الخلايا العصبية الحركية وأجزاء نصفي البطن A3 و A4. عادة ، تمتد سبع خلايا عصبية حركية على الأقل وتلفت محاورها لتشكيل فرع عصبي ISNb. كما كان من الممكن التعرف على العديد من حزم الأعصاب المحيطة في هذا المستحضر. عندما تصل حزمة العصب بين القطاعات إلى نقطة الاختيار في العضلة 6 و 7 ، يقوم محوران انتقائيان بإزالة اللفافة وتنشيط العضلات 6 و 7.

يحدث الشيء نفسه في نقاط الاختيار الأخرى حيث تمتد الحزمة ظهريا. ثم ، عند نقطة الاختيار الأخيرة ، يؤدي محوران إلى تقويض العضلات 12. على النقيض من ذلك ، في الأجنة الطافرة Sema-1a ، تفشل نفس المحاور في إزالة التشنج عند نقاط اختيارها.

هذا ليس غير متوقع كما من المعروف أن منتج Sema-1 aegean يساعد في تكوين اتصالات بين المحاور الحركية والعضلات المستهدفة أثناء التطور العصبي. وبالتالي ، يمكن استخدام الطريقة الموصوفة لتحليل الأنماط الظاهرية الطافرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فرز الأجنة الطافرة المرغوبة ، وكيفية تلطيخ أنماط الإسقاط المحوري للخلايا العصبية الحركية ، وكيفية تشريح الأجنة الثابتة للتحضير المسطح.