التصور الملاحة إكسون موتور والتحديد الكمي أربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس استخدام الورقة الضوء الفلورية مجهرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو السماح بالتقييم النوعي والكمي لأنماط تشجير الخلايا العصبية الحركية باستخدام مجهر الألواح الضوئية وبرنامج تحليل الصور على أجنة الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم تطور الخلايا العصبية الحركية بالتنسيق مع الحركة المعقدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك مراقبة وتصوير أنماط التشجير المحوري للخلايا العصبية الحركية من زوايا مختلفة وتحليل كل عصب على حدة كميا.

سيظهر الإجراء Ya-Ping Yen و Ee Shan Liau ، وهما طالبان دراسات عليا من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بإصلاح الأجنة بشكل فردي في صفيحة من 24 بئرا مع ملليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد المحضر حديثا في PBS لكل بئر عند أربع درجات مئوية على شاكر طوال الليل. في اليوم التالي ، اغسل الأجنة الثابتة ثلاث مرات على الأقل ، كل منها لمدة خمس إلى 10 دقائق ، باستخدام مليلتر واحد من 1X PBS واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم باختراق كل جنين في مليلتر واحد من 0.5٪ PBST بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على شاكر. قم بحظر كل عينة بمليلتر واحد من FBS 10٪ محضرة في 1X PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على شاكر. بعد ذلك ، احتضان كل جنين بملليلتر واحد من الجسم المضاد الأساسي المضاد ل GFP عند 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة مع الاهتزاز المستمر.

بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل كل جنين بمليلتر واحد من 0.5٪ PBST على مدار يوم إلى يومين عند أربع درجات مئوية على شاكر. بعد ذلك ، ضع ملليلترا واحدا من الجسم المضاد الثانوي واحتضنه طوال الليل في الظلام عند أربع درجات مئوية مع رج مستمر. في اليوم التالي ، اغسل كل جنين بمليلتر واحد من 0.5٪ PBST ثلاث مرات على الأقل عند أربع درجات مئوية على شاكر على مدار يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد ذلك ، احتضان كل جنين في كاشف مقاصة تجاري بمعامل انكسار 1.49 ثانية في أنبوب 1.5 مليلتر محمي من الضوء في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قم بإعداد بصريات الإضاءة 5X / 0.1 وبصريات الكشف 5X / 0.16. قم بتجميع حامل العينة والعينة الشعرية.

تحضير غرفة العينة عن طريق ملئها بمحلول المقاصة. لتركيب الجنين، قم بإعداد طرف ماصة P200 عن طريق قطع الجزء العلوي بحيث يناسب قطر الشعيرات الدموية وإزالة الجزء المدبب لمرفق العينة. ثم قم بإذابة الطرف الضعيف لطرف الماصة باستخدام لهب صغير.

أطفئ اللهب وقم بإرفاق الجنين بسرعة عموديا على الطرف الذائب. قم بتركيب الجزء العلوي من طرف الماصة مع العينة الشعرية وضع حجرة العينة المعدة في المجهر. باستخدام برنامج التصوير ، حدد تحديد موقع الشعيرات الدموية ضمن علامة التبويب تحديد الموقع واضبط المحاور X و Y و Z.

بعد ذلك ، حدد تحديد موقع العينة والتكبير إلى 0.6X للتركيز على الجنين. اسمح للمخزن المؤقت للغرفة بالتوازن مع الجنين لبعض الوقت لإزالة أي حطام أو فقاعات. للحصول على الصور ضمن علامة التبويب الاكتساب، حدد معلمات مسار الضوء مثل أهداف المباحث ومرشح حجب الليزر وفاصل الشعاع والكاميرات والليزر.

حدد خانة الاختيار المسح المحوري لتقليل الظل. بعد ذلك ، حدد إعدادات الاستحواذ ، Bit Bepth إلى 16 بت ، Zoom إلى النطاق بين 0.36 و 0.7X ، إضاءة موقع واحد أو إضاءة موقع مزدوج. انقر فوق مستمر واضبط شدة الليزر ووقت التعرض وطاقة الليزر وموضع ورقة الضوء.

بعد ذلك ، اضغط على إيقاف لإنهاء الحصول على الصورة. من المهم التأكد من وضع العينة الشفافة داخل أقصر مسار ضوئي للسماح بالحصول على صور مفصلة للهياكل المتشجرة الدقيقة على الأعصاب الحركية الفردية. للحصول على متعدد الأبعاد، حدد مكدس Z عن طريق تحريك الموضع z للصورة الأولى والأخيرة.

انقر فوق Optimal لتعيين رقم الشريحة. ثم انقر فوق بدء التجربة للحصول على مكدس Z المحدد. عند الانتهاء ، احفظ الصورة بتنسيق ZI.

لتحديد كمية التشجير المحوري ، افتح ملف الصورة في برنامج تحليل التخيل. اضبط لون الصورة وسطوعها وتباينها باستخدام نافذة ضبط العرض لاكتشاف الخيوط بناء على تباين الشدة المحلية. بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة إضافة خيوط جديدة وحدد خوارزمية المسار التلقائي في القائمة المنسدلة.

حدد منطقة الاهتمام ، ثم حدد نقاط البداية والبذور عن طريق تعيين أكبر وأنحف قياسات القطر التي يمكن قياسها باستخدام وضع الشريحة. قم بتعيين نقطة بداية على حافة منطقة الاهتمام. لتحقيق الإضافة أو الإزالة اليدوية لنقاط البداية، قم أولا بتغيير وضع المؤشر، وانتقل إلى التحديد، ثم قم بالإزاحة وانقر بزر الماوس الأيمن في نقاط الاهتمام.

بعد ذلك، حدد العتبات اليدوية للنقاط الأولية للتأكد من وضع علامة على كل الأشجار المرئية. بعد ذلك، قم بإضافة نقاط البذور أو إزالتها يدويا. حدد المربع إزالة المقاطع غير المتصلة وإزالة النقاط الأولية حول نقاط البداية.

بعد ذلك ، اضبط عتبة طرح الخلفية وقم بإنهاء العملية. من الضروري إزالة القطع الأثرية في الخلفية والتأكد من أن مسار الكاشف يعكس التشكيل العصبي الحقيقي من أجل القياس الكمي بدقة. في النهاية ، اختر النمط واللون المطلوبين.

ضمن علامة التبويب الإحصائيات ، حدد مفصل واستخدم رقم الفتيل ، ونقاط التغصنات الطرفية لتحديد الأطراف العصبية الحركية كمؤشر على تشجير المحور العصبي الحركي. بعد ذلك ، قم بتصدير صورة المحور العصبي المعاد بناؤه كملف tiff. يوفر LSFM تصورا ثلاثي الأبعاد مفصلا للتشجير المحوري الحركي في أجنة الفئران.

تخضع الخلايا العصبية الحركية للبروتوكول الموصوف أعلاه ويتم تصنيفها باستخدام GFP المعبر عنه وراثيا. لتصوير تشجير المحور العصبي بمزيد من التفصيل وإجراء القياس الكمي ، يمكن ضبط التكبير بحيث يمكن الكشف عن كل هيكل متشجر بدقة. أخيرا ، يمكن إعادة بناء نمط التشجير المحوري للأعصاب الأمامية الفردية باستخدام برنامج تحليل الصور.

خوارزمية المسار التلقائي في البرنامج الفتيل وتحدد العدد الإجمالي لمحطات المحاور العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات وتصوير محاور الخلايا العصبية الحركية لأجنة الفئران باستخدام مجهر الفلورسين الخفيف. أيضا ، ستعرف كيفية التقييم الكمي لنمط التشجير لكل أعصاب حركية فردية بواسطة MRS.