تقييم الدالة Microvascular الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام فيديوميكروسكوبي

الهدف العام من تقنية المجهر الفيديوية هذه هو فحص الخصائص الوظيفية للأوعية الدموية الدقيقة المعزولة استجابةً للمحفزات الدوائية والفسيولوجية، مما يوفر رؤية حول الاعتلالات المرضية والآليات الجزيئية التي تساهم في الخلل الوظيفي الوعائي لدى البشر. وتعد هذه الطريقة مفيدة لفهم الآليات الجزيئية التي تساهم في الخلل الوظيفي للأوعية الدموية الدقيقة المحلية داخل الدهون، وهو الأمر الذي تم ربطه بالأمراض الجهازية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الأوعية الدموية تظل وظيفية لفترة من الزمن بعد إزالتها من جسم الإنسان، ويمكن فحص خصائصها الفسيولوجية بسهولة.

تكمن الأهمية السريرية لهذا النهج التجريبي في أنه يسمح لنا بتحديد المسارات التي تتغير بشكل متفاوت في الحالات المرضية، ومن المحتمل أن يؤدي إلى اكتشاف أهداف علاجية جديدة. وباستخدام مجهر تشريح الأنسجة، استعمل مقصات مجهرية وملاقط مجهرية لإزالة الدهون والأنسجة الضامة المحيطة بالشرايين الصغيرة داخل عينة النسيج الدهني بعناية. ومن الضروري التمييز بين الشرايين والوريدات.

تكون الشرايين عادةً أصغر قطرًا، وتُظهر توترًا أكبر، وتستجيب بشكل أقوى مقارنةً بالوريدات. عند عزل الشريان، استخدم خيوط جراحة من النايلون أو الحرير لربط أي تفرعات. بعد ذلك، استخدم محقنة سعة 10 milliliter لملء الأنبوب ببطء بمحلول Krebs الطازج.

بعد ذلك، قم بتوصيل الأنابيب المطاطية بخزانات الضغط وماصات الشعيرات الزجاجية داخل الغرفة. بعد ذلك، انقل الشريان الذي تم تشريحه إلى غرفة العضو وقم بتنبيط الوعاء على ماصات الشعيرات الزجاجية. ثبت كلا طرفي الشريان بعناية على الماصات باستخدام خيوط جراحية من النايلون.

بمجرد تثبيت الوعاء، قم بإزالة منظم كريبس (Krebs buffer) ببطء من الغرفة وأضف 2 mL من محلول كريبس الطازج إلى الغرفة. بعد ذلك، قم بتثبيت غرفة العضو على منصة مجهر مقلوب مجهز بكاميرا فيديو. قم بتشغيل برنامج اكتشاف الحواف بمعدل أخذ عينات يبلغ 1 kHz.

قم بتوصيل الأنابيب المضغوطة المتبقية بخزان الضغط الثاني المملوء بمحلول Krebs، ثم قم بتوصيل خزانات الضغط بمحول الضغط. بمجرد توصيل جميع الأنابيب، اضبط وحدة التسخين على 37 °C. بعد ذلك، استخدم وحدة التحكم في الضغط لزيادة الضغط داخل اللمعة تدريجياً بمقدار 5 mmHg كل خمس دقائق للوصول إلى الضغط التجريبي المناسب داخل لمعة الوعاء الدموي المعزول.

اترك الوعاء الدموي ليتوازن لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة بمجرد وصول الضغط إلى 60 milliliters of mercury، وسجل قطر الشريان الدهني في حالة الراحة. في نهاية فترة التوازن، قم بتضييق الوعاء الدموي مسبقاً إلى ما يقرب من 55% من قطر خط الأساس في حالة الراحة عن طريق إضافة one microliter من endothelin 1 مباشرة إلى الحمام كل خمس دقائق حتى يتم تضييق قطر الوعاء بشكل مناسب. ولتحفيز تمدد الأوعية الدموية المعتمد على البطانة والمستحث بالتدفق، قم بإحداث تدفق مستمر داخل الحيز اللمعي للشريان في اتجاهات متساوية ومتعاكسة، بحيث يمكن تكوين فرق ضغط عبر الوعاء دون تغيير متوسط الضغط داخل اللمعة البالغ 60 millimeters mercury.

بعد مرور ثلاث إلى خمس دقائق، قم بقياس التوسع المعتمد على التدفق. قم بزيادة كل درجة من تدرج الضغط بمقدار 10 centimeter of water كل خمس إلى ست دقائق، وصولاً إلى حد أقصى قدره 100 centimeters of water. بعد تقييم توسع الوعاء المعتمد على التدفق، أعد خزانات الضغط إلى الارتفاع نفسه لإيقاف تحفيز التدفق.

بعد ذلك، استبدل محلول الغرفة فوراً وبحذر بمحلول Krebs جديد دون إزعاج الشريان المعلق، واترك الوعاء ليعود إلى القطر الأساسي لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة. وبمجرد عودة الشريان إلى قطر الأساس في حالة الراحة، يمكن تقييم توسع الأوعية الدموية المعتمد على البطانة والذي يتوسطه الكولين. يبدأ ذلك بتضييق الوعاء مسبقاً إلى حوالي 55% من قطر الراحة باستخدام endothelin 1، كما تم توضيحه سابقاً.

بمجرد تحقيق التضيق المسبق، أضف ميكرولترين من جرعات متزايدة من acetylcholine مباشرة إلى الحمام. سجل التغير في قطر الشريان بعد خمس دقائق من إعطاء كل جرعة. وعند الانتهاء من استجابة جرعة acetylcholine، قم بتقييم توسع الأوعية الدموية المستقل عن البطانة وحيوية الوعاء الدموي من خلال الإعطاء المتسلسل لـ papaverine وموسع أوعية دموي مستقل عن البطانة مباشرة في الحمام.

تكون استجابات توسع الأوعية الدموية المعتمدة على البطانة لزيادة التدفق وإجهاد القص أو الأستيل كولين ضعيفة بشكل ملحوظ في الشرايين الدهنية الحشوية مقارنة بالشرايين الدهنية تحت الجلد لدى البشر المصابين بالسمنة. ومع ذلك، فإن توسع الأوعية الدموية غير المعتمد على البطانة استجابةً للبابافيرين لا يتغير بشكل متفاوت بين النوعين من الدهون، مما يشير إلى أن الخلل الوعائي في النطاقات الحشوية ناتج إلى حد كبير عن خلل على مستوى البطانة، على الأقل في المراحل المبكرة من المرض. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ثلاث إلى خمس ساعات، إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التمهل والدقة، حيث إن أي تلف بسيط في الأوعية الدموية قد يؤدي إلى تحريف النتائج. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ترانسفكشن siRNA للأوعية الدموية للإجابة على تساؤلات إضافية حول تأثير جينات محددة على الوظيفة الوعائية الحركية في الأمراض البشرية. وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأنسجة الدهنية والدورة الدموية الدقيقة لاستكشاف تأثير البيئة الدقيقة للأنسجة الدهنية على الصحة الوعائية المحلية في حالات السمنة البشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية سبر الفيزيولوجيا المرضية لقطع كاملة وسليمة من الأوعية الدموية البشرية التي يتم استئصالها من أشخاص أحياء بشكل مباشر، وهي عملية لا يمكن تكرارها عن طريق التصوير غير الجراحي.