تقييم الدالة Microvascular الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام فيديوميكروسكوبي

الهدف العام من تقنية الفحص المجهري بالفيديو هذا هو فحص الخصائص الوظيفية للأوعية الدقيقة المعزولة استجابة للمنبهات الدوائية والفسيولوجية ، مما يوفر نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية والآليات الجزيئية التي تساهم في خلل الأوعية الدموية لدى البشر. هذه الطريقة مفيدة لفهم الآليات الجزيئية التي تساهم في خلل الأوعية الدموية الدقيقة المحلية داخل الدهون ، والتي تم ربطها بالأمراض الجهازية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الأوعية الدموية تظل تعمل بعد إزالتها من جسم الإنسان لفترة من الوقت ويمكن فحصها بسهولة لخصائصها الفسيولوجية.

تتمثل الأهمية السريرية لهذا النهج التجريبي في أنه يسمح لنا بتحديد المسارات التي تتغير بشكل تفاضلي في حالات المرض واكتشاف أهداف علاجية جديدة. تحت مجهر تشريح الأنسجة ، استخدم المقص الدقيق والملقط الدقيق لإزالة الدهون المحيطة والأنسجة الضامة بعناية من الشرايين الصغيرة داخل العينة الدهنية. من الضروري التمييز بين الشرايين والأوردة.

عادة ما تكون الشرايين أصغر في القطر ، وتظهر نغمة أكبر ، وتستجيب بقوة أكبر من الأوردة. عندما يتم عزل الشريان ، استخدم خيوط النايلون أو الحرير لربط أي فروع. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لملء الأنبوب ببطء بمحلول كريبس الطازج.

بعد ذلك، قم بتوصيل الأنابيب المطاطية بخزانات الضغط والماصات الشعرية الزجاجية داخل الغرفة. بعد ذلك ، انقل الشريان المقطوع إلى حجرة الأعضاء وقم بتقطيع الوعاء إلى الماصات الشعرية الزجاجية. قم بتأمين طرفي الشريان بعناية على الماصات بخيوط نايلون.

بمجرد أن يصبح الوعاء آمنا ، قم بإزالة عازلة Krebs ببطء من الغرفة وأضف ملليلترين من محلول Krebs الطازج إلى الغرفة. بعد ذلك ، قم بتوصيل غرفة العضو بمرحلة المجهر المقلوب المزود بكاميرا فيديو. قم بتشغيل برنامج الكشف عن الحواف بمعدل أخذ عينات يبلغ كيلو هرتز واحد.

قم بتوصيل الأنبوب المضغوط المتبقي بخزان الضغط الثاني المملوء بمحلول كريبس ثم قم بتوصيل خزانات الضغط بمحول الضغط. عندما يتم توصيل جميع الأنابيب ، اضبط كتلة التسخين على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم وحدة التحكم في الضغط لزيادة الضغط داخل اللمعة تدريجيا إلى خمسة ملليلتر من الزئبق كل خمس دقائق لتحقيق الضغط التجريبي المناسب داخل تجويف الأوعية الدموية المعزولة.

اسمح للوعاء بالتوازن لمدة 20 إلى 30 دقيقة بمجرد أن يصل الضغط إلى 60 مل من الزئبق وسجل قطر الشريان الدهني أثناء السكون. في نهاية فترة التوازن ، قم بتضييق الأوعية الدموية مسبقا إلى ما يقرب من 55٪ من قطر خط الأساس المريح عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من البطانة 1 مباشرة إلى الحمام كل خمس دقائق حتى يتم تقليص قطر الوعاء الدموي بشكل مناسب. بالنسبة لتوسع الأوعية البطانية الناجم عن التدفق ، قم بتحفيز التدفق المستمر في الفضاء داخل اللمعة للشريان في اتجاهين متساويين ومتعاكسين بحيث يمكن تطوير فرق الضغط عبر الوعاء دون تغيير متوسط الضغط داخل اللمعة البالغ 60 ملم زئبق.

بعد ثلاث إلى خمس دقائق ، قم بقياس التمدد بوساطة التدفق. قم بزيادة كل زيادة في تدرج الضغط بمقدار 10 سنتيمترات من تغيير الماء كل خمس إلى ست دقائق بحد أقصى 100 سم من الماء. بعد تقييم تمدد الوعاء بوساطة التدفق ، أعد خزانات الضغط إلى نفس الارتفاع لإيقاف تحريض التدفق.

ثم على الفور ، ولكن بعناية استبدل محلول الغرفة بمحلول كريبس الطازج دون إزعاج الشرايين المعلقة واسمح للوعاء بالبدء في العودة إلى قطر خط الأساس لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بمجرد عودة الشرايين إلى قطر خط الأساس الراحة, يمكن تقييم توسع الأوعية المعتمدة على بطانة الكولين خفية. يبدأ هذا بتضييق الوعاء مسبقا إلى ما يقرب من 55٪ من قطر الراحة مع البطانة 1 ، كما هو موضح سابقا.

بمجرد تحقيق الانقباض المسبق ، أضف ميكرولترين من الجرعات المتزايدة من الأسيتيل كولين مباشرة إلى الحمام. تسجيل التغير في قطر الشرايين بعد خمس دقائق من إعطاء كل جرعة. عند الانتهاء من استجابة جرعة الأسيتيل كولين ، قم بتقييم توسع الأوعية البطانية المستقل وصلاحية الأوعية الدموية عن طريق الإدارة المتسلسلة لموسع الأوعية الدموية المستقل عن البابافيرين والبطانة مباشرة إلى الحمام.

تستجيب توسع الأوعية المعتمدة على اندوثيليوم لزيادة التدفق والإجهاد المطلق أو الأسيتيل كولين ضعيفة بشكل كبير في الشرايين الدهنية الحشوية مقابل تحت الجلد في السمنة البشرية. ومع ذلك ، فإن توسع الأوعية الدموية المستقل عن البطانة استجابة للبابافيرين لا يتغير بشكل تفاضلي بين القسمين ، مما يشير إلى أن الخلل الوظيفي الوعائي في المجالات الحشوية هو إلى حد كبير نتيجة لخلل وظيفي على مستوى البطانة ، على الأقل في المراحل المبكرة من المرض. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ثلاث إلى خمس ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تأخذ وقتك وأن تكون مجتهدا ، حيث أن الأضرار الطفيفة التي تلحق بالأوعية الدموية قد تؤدي إلى تحريف النتائج. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تعداء siRNA للأوعية الدموية للإجابة على أسئلة إضافية حول تأثير جينات معينة على الوظيفة الحركية الوعائية في الأمراض البشرية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأنسجة الدهنية ودوران الأوعية الدقيقة لاستكشاف تأثير البيئة الدقيقة للأنسجة الدهنية على صحة الأوعية الدموية المحلية في السمنة البشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحقيق المباشر في الفيزيولوجيا المرضية لأجزاء كاملة سليمة من الأوعية الدموية البشرية ، والتي يتم إزالتها من الأشخاص الأحياء ، وهي عملية لا يمكن تكرارها عن طريق التصوير غير الجراحي.