استخراج عينة والمتزامن كوانتيتيشن الكروماتوغرافي ميتوتريكسات وج ميتوميسين عقب تسليم تركيبة المخدرات في جسيمات نانوية للفئران الحاملة للورم

الهدف العام لهذا البروتوكول التحليلي هو استخراج وقياس الدواءين المضادين للسرطان في وقت واحد دوكسوروبيسين وميتومايسين سي ، اللذين يتم توصيلانهما بشكل مشترك بواسطة جزيئات نانوية هجينة من البوليمر والدهون ، ومستقلب دوكسوروبيسين ، دوكسوروبيسينول ، في المصفوفات البيولوجية باستخدام طريقة كروماتوغرافيا سائلة بسيطة وقوية عالية الأداء ذات المرحلة العكسية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب النانوي ، مثل كيفية تصميم نظام حمل نانوي فعال يعتمد على الحركية الدوائية النانوية لمجموعات الأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي المتزامن لثلاثة مركبات دوائية في نفس المصفوفة البيولوجية ، دون الحاجة إلى تغيير المرحلة المتنقلة من HPLC.

لذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للسلوكيات البيولوجية لدوكسوروبيسين وميتومايسين سي ودوكسوروبيسينول في أورام الثدي الأولية. يمكن تطبيقه أيضا على أنواع السرطان الأخرى التي تعالج بأدوية مماثلة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات إعداد العينة الفعالة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بجمع وتجميد الدم الكامل والأعضاء الرئيسية وورم الثدي كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بوزن المناديل المجمدة بسرعة وسجل الوزن على دفتر ملاحظات المختبر. ثم انقلها إلى أنبوب مخروطي القاع المستدير سعة 13 مل.

بعد ذلك ، أضف ما بين واحد وخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المثلجة. باستخدام الخالط اليدوي الكهربائي ، قم بتجانس الأنسجة بحركة سكتة دماغية لأعلى ولأسفل على الجليد عند 18 ، 000 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، اغسل مسبار مولد الأسنان المنشار 10 ملم بالماء المقطر منزوع الأيونات.

اغسل المسبار بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم مرة أخرى بالماء المقطر منزوع الأيونات. انقل 50 ميكرولترا من دم متجانس أو دم كامل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر. ثم, ارتفاع مع خمسة ميكرولتر من 2, 000 نانوغرام لكل مليلتر معيار داخلي 4-MethylUmbelliferone.

أضف مذيب استخراج الجليد البارد الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من الأسيتونيتريل و 100 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم بخمسة ملليمول. دوامة الخليط بقوة لمدة دقيقتين. جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق طازج مبرد مسبقا. استخدم تيارا بطيئا من غاز النيتروجين لتبخر المادة الطافية عند 60 درجة مئوية مع الحماية من الضوء. بعد ذلك ، أعد تكوين البقايا المجففة ب 100 ميكرولتر من الميثانول المثلج.

دوامة بقوة لمدة 30 ثانية. جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم انقل المادة الطافية إلى إدراج قارورة HPLC.

ضع قوارير العينة في صينية أخذ العينات الأوتوماتيكية للحقن. للبدء ، قم بإعداد مرحلة HPLC المتنقلة كما هو موضح في بروتوكول النص. اضبط الشروط الأولية لتكوين الطور المتحرك على 16.5٪ H2O و 83.5٪ أسيتونيتريل.

اضبط معدل التدفق المتساوي على 1.0 ملليلتر في الدقيقة. بعد ذلك ، افصل الأدوية باستخدام حالة الطور المتنقل المتدرج كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، اضبط كاشف الأشعة فوق البنفسجية على قناتين: واحدة عند 310 نانومتر للمعيار الداخلي 4-MethylUmbelliferone والأخرى عند 360 نانومتر ل Mitomycin C. بعد ذلك ، اضبط القناة الأولى لكاشف الإزهار على طول موجة إثارة يبلغ 365 نانومتر ، وطول موجة انبعاث يبلغ 445 نانومتر ل 4-MethylUmbelliferone.

اضبط القناة الثانية على طول موجة إثارة يبلغ 480 نانومتر ، وطول موجة انبعاث يبلغ 560 نانومتر لدوكسوروبيسين ودوكسوروبيسينول. للبدء ، استخدم جهاز أخذ العينات التلقائي لحقن 15 ميكرولترا من العينة. يتغير تكوين الطور المتنقل المتدرج المبرمج تلقائيا عن طريق زيادة تكوين الأسيتونيتريل على مدى صفر إلى 18 دقيقة.

بعد 18 دقيقة ، يتم إعادة إنشاء حالة الطور المتحرك إلى الحالة الأولية وإعادة موازنتها للحقن التالي. بعد تشغيل كل عينة ، لاحظ قمم مركبات الدواء وأوقات الاحتفاظ بها. بعد ذلك ، استخدم برنامج HPLC لدمج منطقة الذروة تحت المنحنى لمركبات الأدوية.

احسب نسبة تعافي الدواء والمساحة تحت نسبة المنحنى بين كل مركب دوائي والمعيار الداخلي ، كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذا الإجراء ، يتم الكشف عن عقارين مضادين للسرطان ، دوكسوروبيسين وميتومايسين سي ، جنبا إلى جنب مع مستقلب دوكسوروبيسين ، دوكسوروبيسينول ، دون تدخل بيولوجي. يظهر تحليل HPLC أن كل دواء منفصل جيدا عن الآخرين.

تعرض طريقة HPLC التي تم تطويرها أقل من 15٪ من التباين في الدقة والدقة بين اليوم وفيما بينها لكل من الأدوية التي تمت دراستها ، في كل من الدم الكامل والمصفوفات البيولوجية المختلفة ، مما يشير إلى قابلية استنساخ ممتازة. ثم يتم تحديد التوزيع الدوائي والحيوي للتسليم المشترك القائم على الجسيمات النانوية طويلة الدوران أو القائم على البكسيلات الدوكسوروبيسين والميتومايسين سي. في الدم ، ينظر إلى تركيزات الدواء التي يتم تسليمها بواسطة الجسيمات النانوية الهجينة البوليمرية والدهون بمرور الوقت على أنها أعلى بستة أضعاف على الأقل من محاليل الأدوية الحرة المكافئة.

في ورم الثدي التقويمي ، يمكن للجسيمات النانوية الهجينة من البوليمر والدهون أن تشارك في توصيل دوكسوروبيسين وميتومايسين سي بنسبة الدواء التآزرية. بالمقارنة مع محلول الأدوية الحرة ، ينظر إلى الجسيمات النانوية على أنها زادت من تراكم الورم. ويرجع ذلك إلى الدورة الدموية المنتظمة المطولة ، والتي تسمح للجسيمات النانوية باستغلال النفاذية المحسنة وتأثيرات الاحتفاظ بالورم.

يشير التكوين الإضافي المحدد كميا لدوكسوروبسينول في ورم الثدي على مدار 24 ساعة ، جنبا إلى جنب مع موت الخلايا المبرمج المعزز للورم ، إلى أن التوافر البيولوجي للأدوية أمر بالغ الأهمية في تصميم تركيبة فعالة للجسيمات النانوية. باستخدام طريقة HPLC هذه ، تم إثبات أن الجسيمات النانوية الهجينة من البوليمر والدهون يمكن أن توفر بدقة تركيبة دوائية تآزرية في الخلايا السرطانية في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى تحسين العلاج الكيميائي. يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

لتقليل النهب المحتمل للأدوية ، من المهم أن تتذكر تجنب أشعة الشمس المباشرة والاحتفاظ بالعينة على الجليد أثناء محاولة هذا الإجراء. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال الطب النانوي لاستكشاف الحركية الدوائية النانوية لتركيبة الأدوية ، وتصميم تركيبة الجسيمات النانوية الفعالة لعلاج السرطان بشكل أفضل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية الاستخراج المتزامن واكتشاف دوكسوروبيسين ، ميتومايسين سي ، ومستقلب دوكسوروبيسين ، دوكسوروبيسينول ، على نطاقات واسعة من العينات البيولوجية التي تحتوي على جسيمات نانوية محملة بتركيبة الدواء.

لا تنس أن العمل مع الأدوية المضادة للسرطان والحمض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما تطبيق احتياطات السلامة مثل ارتداء القفازات والنظارات الواقية ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.